ARTIGO ORIGINAL

Comparação entre dois métodos de obtenção de DNA a serem usados como protocolos alternativos para a detecção de parasitas humanos causadores de malária por nested PCR

Giselle Maria Rachid Viana; Danielle Regina Lima Barbosa; Ediclei Lima do Carmo; José Mário Veloso Peres; José Maria Souza Nascimento; Marinete Marins Póvoa

Laboratório de Pesquisas Básicas em Malária, Seção de Parasitologia, Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil

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Título original: Comparison of two DNA obtainment methods as alternative protocols for the detection of human malária parasites by nested PCR. Traduzido por: André Monteiro Diniz.

RESUMO

Um diagnóstico laboratorial correto e preciso de malária humana ainda é considerado um desafio, pois o método de referência, o da gota espessa com colocação pelo Giemsa, apresenta limitações que dificultam o controle da malária. Devido a esses problemas, várias pesquisas têm objetivado desenvolver métodos alternativos para o diagnóstico da malária. Grande parte desses estudos aborda métodos de diagnóstico molecular, que têm acarretado o desenvolvimento de algumas alternativas ao método de coloração pelo Giemsa. No entanto, esses métodos, por sua vez, apresentam suas limitações, que incluem seu alto custo, a complexidade do protocolo e a variação da qualidade das fontes de DNA e de reagentes. Neste aspecto, a técnica de nested PCR tem demonstrado ser um bom método e pode ser melhorado usando uma fonte de DNA de alta qualidade. Neste estudo foram avaliados dois métodos para a obtenção de DNA de amostras de sangue seco colhidas em papel de filtro: 1) lavagem e 2) saponina/Chelex-100. O segundo método apresentou sensibilidade e especificidade mais altas em relação ao primeiro, pois detectou mais infecções, tanto simples como mistas, bem como infecções por Plasmodium malariae. Com base nesses resultados, apresentamos o segundo como o protocolo de escolha para a obtenção de DNA. A técnica de nested PCR usando saponina/Chelex-100 para extração de DNA pode ser um método alternativo ou complementar de diagnóstico de parasitas da malária humana, mas não é considerado adequado para o uso de rotina.

Palavras-chave: Malária; DNA; Reação em Cadeia da Polimerase.

INTRODUÇÃO

A malária é um dos principais problemas de saúde pública no Brasil e atinge especialmente populações pobres na Região Amazônica^16,18. A identificação precisa das espécies de Plasmodium que infectam humanos é de extrema importância para que seja viabilizado o seu tratamento de forma rápida e adequada. O método de referência para o diagnóstico de malária é o esfregaço de gota espessa com coloração de Giemsa (TS); apresenta baixo custo, boa sensibilidade, permite a identificação das formas das espécies de Plasmodium em todas as fases de desenvolvimento e a quantificação dos estágios do parasita^8,21.   Geralmente,  sua  sensibilidade  para   a detecção pelo microscopista varia entre 10-30 paras¡tas/µL de sangue; no entanto, esta sensibilidade pode ser limitada quando há uma grande quantidade de amostras a serem examinadas em um intervalo de tempo muito curto. É possível obter resultados falsos-negativos devido aos baixos níveis de parasitemia, à existência de infecções mistas ou inexperiência por parte do microscopista. Este fato pode comprometer uma das principais estratégias de controle da malária: um diagnóstico rápido e preciso, que viabilize a realização do tratamento adequado^2,3,7,20.

Para suplantar algumas limitações do método TS, alguns métodos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR), como o protocolo Nested-PCR desenvolvido por Kimura et al¹¹, têm sido utilizados para detectar e identificar parasitas da malária. Esses métodos são mais sensíveis e específicos que o TS e podem detectar até mesmo um único parasita por microtítulo de sangue^5,10,21,23. Contudo, o sucesso de uma técnica de PCR depende de vários fatores, tais como a qualidade dos reagentes e do DNA obtido de diferentes fontes. Além disso, já foi demonstrado que a amplificação de DNA de amostras de sangue seco em papel-filtro é uma fonte confiável de DNA quando as condições de transporte, de manipulação e armazenamento são consideradas adequadas para evitar a contaminação ou degradação do DNA^1,4,6,12. Por esta razão, é importante testar diferentes métodos de obtenção de DNA como protocolos alternativos de detecção de parasitas da malária humana por Nested-PCR. Este estudo objetivou comparar as duas seguintes técnicas: 1) Extração de DNA por procedimento de lavagens²⁶, e 2) Extração de DNA por meio de tratamento d e amostras de sangue seco com saponina/Chelex-100 em papel-filtro²⁷.

MATERIAIS E MÉTODOS

Utilizamos neste estudo 75 amostras de sangue seco positivas (parasitemia variando de 0,001% a 2%) e 78 negativas em discos de papel-filtro Whatma^®, de 2,5 cm de diâmetro (Titertek, ICN Biomedicals - England). As amostras de sangue foram coletadas de habitantes dos Municípios de Novo Repartimento (04^o14' 55'' N; 50^o 07' 25'' W), Parauapebas (06o 04' 03" N; 49^o 54' 08" W), Tucuruí (03^o 45' 03" N; 49^o 40' 03" W) e Belém (01^o 27' 20" N; 48^o 30' 15" W), no Estado do Pará. Os controles para cada parasita da malária humana incluíram amostras positivas bem caracterizadas e água ultrapura e DNA humano para os controles negativos. Todas as amostras foram testadas e diagnosticadas segundo o método de esfregaço de gota espessa com coloração de Giemsa (TS). A quantificação dos parasitas foi realizada nas lâminas com amostras positivas¹⁴.

DNA OBTIDO PELO MÉTODO DE LAVAGEM

As amostras de papel-filtro foram preparadas colocando-se cinco gotas de 20 µL de cada amostra em discos de papel-filtro Whatman^® (2,5 cm de diâmetro) (Titertek, ICN Biomedicals - England) e secando-as em temperatura ambiente (TA, 25-27^o C). As amostras foram então armazenadas em embalagens plásticas previamente identificadas (BHL Limited, Poole - England), que haviam sido mantidas a uma temperatura de -20^o C até a sua utilização. Foram lavadas com água destilada e solução salina 0,9%, utilizando um sistema de filtragem Millipore^® para remover todos os inibidores de PCR²⁶.

EXTRAÇÃO DE DNA PELO MÉTODO DE SAPONINA/CHELEX-100

Um quarto de cada gota seca em papel-filtro foi cortado em pequenos pedaços e incubado em gelo com solução de saponina 0,5% em PBS por 1 h. Posteriormente, a solução foi misturada usando-se um "vórtex" e o sobrenadante foi descartado. Foi feita então uma lavagem com PBS, foi adicionada uma solução de Chelex-100 20% em água e a solução foi incubada em banho seco por 1 h. Após a incubação, o sobrenadante foi transferido para tubos Eppendorf^® estéreis e armazenado a -20^o C²⁷.

REAÇÃO DE NESTED-PCR

A reação de amplificação da subunidade do gene 18S do RNA ribossô mico (rRNA) do Plasmodium (ssu-rRNA) foi conduzida de acordo com o descrito no protocolo de Kimura et al¹¹. Os primers P1 e P2 foram utilizados como primers universais no primeiro ciclo, e os primers F2, M1 e V1 foram utilizados como primers específicos para P. falciparum, P. malariae e P. vivax, respectivamente, no segundo ciclo. Os produtos obtidos pela Nested-PCR foram fracionados por meio de eletroforese em gel de agarose 2% (Ultra pure agarose, BRL 155517-014) a 100 V por 1 h e corada com brometo de etídio (5 µL/mL). Os tamanhos esperados dos produtos da PCR eram de 130 bp para o primeiro estágio e 100-110 bp para o segundo estágio. Os técnicos que realizaram a Nested-PCR não tiveram ciência dos resultados obtidos pela análise por microscopia.

ÉTICA

O protocolo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Evandro Chagas (004/2003-CEP/IEC/SVS/MS). Os objetivos e procedimentos do estudo foram devidamente explicados para todos os participantes; todos os pacientes assinaram termo de consentimento livre e esclarecido e dados sociodemográficos e clínicos foram coletados.

RESULTADOS

Das 153 amostras, 49,01% (75/153) foram positivas pelo TS (com parasitemia variando de 0,001% a 2,0%) e 50,98% (78/153) foram negativas. Pela Nesfed-PCR, 43,79% (67/153) das amostras foram positivas e 56,20% (86/153) foram negativas com o método de extração do DNA por procedimento de lavagem, enquanto 51,63% (79/153) foram positivas e 48,36% (74/153) foram negativas com o método por saponina/Chelex-100 (Tabela 1).

O desempenho da Nesfed-PCR comparada com o TS foi o seguinte: 1) método de lavagem - sensibilidade = 89,33%, especificidade = 100%, acurácia = 94,77%; 2) saponina/Chelex-100 - sensibilidade = 100%, especificidade = 94,87%, acurácia = 97,39%. A concordância entre esses métodos ea análise por microscopia foi quase perfeita [Kappa = 0,8952 e 0,9477, respectivamente; IC 95%: variação de 0,80 a 1,00]. O método de saponina/Chelex-100 fornece amostras de DNA de melhor qualidade do que o método de lavagem.

A frequência de espécies de Plasmodium e de infecções mistas detectadas pela Nesfed-PCR usando o DNA extraído pelos métodos de lavagem e saponina/Chelex-100 está demonstrada na Tabela 2. O método de saponina/Chelex-100 forneceu melhores amostras de DNA, o que é demonstrado pelo fato de que, com este método, a Nesfed-PCR pôde detectar tanto infecções simples como mistas por P. malariae, e detectou um número maior de outras infecções do que o método de lavagem.

A figura 1 apresenta os resultados da análise por Nesfed-PCR usando DNA obtido pelo método de saponina/Chelex-100. As faixas 2, 3 e 4 contêm amostras de um único paciente; cada poço corresponde a reações para P. falciparum, P. malariae e P. vivax, respectivamente, demonstrando que o paciente apresenta uma infecção mista por P. malariae e P. vivax.

DISCUSSÃO

Apesar de o TS ainda ser o método de referência para o diagnóstico de malária, as técnicas moleculares são mais sensíveis e específicas para detectar parasitas e podem ser utilizadas para avaliar o desempenho das análises por microscopia^20,28.

As amostras de sangue seco em papel-filtro constituem um método simples e acessível para coleta e armazenamento. Eles têm sido amplamente utilizados em triagem para diagnóstico, análise genética e estudos sobre epidemiologia molecular em áreas remotas com clima tropical, onde as condições de transporte e armazenamento não são ideais. A perda de sensibilidade de métodos baseados em PCR devido às condições de campo já foi reportada e é provavelmente causada pela baixa pureza, estabilidade e integridade do DNA obtido de amostras de sangue em papel-filtro. Um problema observado com a coleta em papel-filtro é a limitação no volume de amostras que podem ser utilizadas para a extração de DNA. Portanto, um bom isolamento do DNA é fundamental para assegurar a qualidade e eficácia de métodos moleculares^7,20.

Vários estudos visaram reduzir os custos de protocolos baseados em PCR, bem como torná-los rápidos e precisos. Um fator essencial do protocolo para a aquisição de bons resultados é a obtenção de uma amostra de DNA de boa qualidade^1,5,6,7.

Neste estudo realizamos uma análise comparativa de dois protocolos para a obtenção de DNA, levando em consideração o tempo necessário, seus custos e a qualidade do DNA extraído⁷. Os resultados demonstraram que a técnica de Nested-PCR com procedimento de lavagem não detectou oito amostras positivas (seis com P. vivax e dois com P. falciparum) identificadas por TS, enquanto o método de Nested-PCR com saponina/Chelex-100 detectou todas as amostras positivas identificadas por TS, bem como outras cinco amostras (três infecções simples por P. malariae e duas infecções mistas por P. vivax e P. malariae). Uma razão possível para a falha na detecção de algumas amostras positivas se deve ao fato de que o método de lavagem não eliminou inibidores de Nested-PCR adequadamente, como a hemoglobina. Os resultados demonstraram que o método de Nested-PCR com saponina/Chelex-100 se mostrou mais sensível e específico que o de lavagem, especialmente para a detecção de P. malariae.

Análises da extração de DNA com lavagem e com saponina/Chelex-100, como descrito por Warhurst et al²⁶ e Wooden et al²⁷, respectivamente, de 153 amostras de sangue seco em papel-filtro demonstraram que ambos os métodos são sensíveis e apresentam alta especificidade, além de serem de realização fácil e rápida. Além disso, pelo fato de esses métodos constituírem protocolos in house, seus custos foram mais baixos do que os kits comerciais disponíveis. No entanto, o método com saponina/Chelex-100 foi considerado mais sensível e, consequentemente, deveria ser o protocolo de escolha para a detecção de parasitas de malária com base na extração de DNA por Nested-PCR.

O protocolo de Nested-PCR desenvolvido por Kimura et al¹¹ para espécies de Plasmodium que infectam humanos demonstrou ser útil, pois é bastante sensível, específico, é possível de ser reproduzido e não apresenta evidências de contaminação   cruzada   no   estudo.   Utilizando   este protocolo, detectamos infecções mistas que haviam sido identificadas por TS como infecções simples, o que corrobora com os dados apresentados por Ebrahimzadeh et al⁵ , Scopel et al²¹ , Singh et al²², Snounou et al²⁴ e Toma et al²⁵.

Em casos de infecção mista, há predominância de uma espécie de Plasmodium, que normalmente é a detectada por ambas as técnicas, TS e PCR, enquanto que a espécie não dominante é identificada apenas por métodos baseados em análises de PCR. Além disso, um baixo nível de parasitemia de P. malariae é frequente principalmente em infecções mistas, provavelmente por causa das características desta espécie e do mecanismo de regulação dependente de densidade. Por isso, esta espécie poderia passar facilmente sem ser notada em análises por microscopia quando P. falciparum ou P. vivax são as espécies dominantes. Este fato também ajuda a explicar o maior número de infecções mistas detectadas por meio de métodos de biologia molecular, quando comparado com as ferramentas microscopias tradicionais²⁷.

Os métodos de diagnóstico de malária baseados em PCR são bastante específicos e sensíveis; no entanto, não podem substituir as análises convencionais por microscopia para uso de rotina⁹, pois não permitem a quantificação das formas de parasitas. Ademais, eles são técnicas complexas, com várias etapas e alto custo. Portanto, eles podem ser úteis como ferramentas alternativas e complementares para o diagnóstico de malária humana em países em desenvolvimento^4,13,19,22.

CONCLUSÃO

Os resultados sugerem a ocorrência de infecções mistas (P. falciparum + P. vivax; P. vivax + P. malariae) na área investigada, as quais não foram identificadas pelo método de microscopia convencional (TS). Além disso, os dois métodos para obtenção de DNA analisados, o de lavagem²⁶ e o de extração com saponina/Chelex-100²⁷, apresentaram sensibilidade e alta especificidade, bem como um custo mais baixo em comparação com os kits comerciais; eles também foram considerados de execução fácil e rápida. O segundo método, no entanto, foi considerado mais sensível: ele fornece um protocolo simples para a extração de DNA de amostras de sangue seco e poderia ser o protocolo de escolha para a obtenção do DNA.

AGRADECIMENTOS

A Ivana Pimentel e aos técnicos do Laboratório de Pesquisa em Malária do Instituto Evandro Chagas por seu apoio técnico.

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Correspondência / Correspondence / Correspondencia:
Giselle Maria Rachid Viana
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E-mail:giselleviana@iec.pa.gov.br

Recebido em / Received / Recibido en: 23/7/2009
Aceito em / Accepted / Aceito en: 21/9/2010