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Desenvolvimento de PCR multiplex para detecção e diferenciação de categorias de Escherichia coli diarreiogênicas

 

Development of multiplex PCR to detect and differentiate the categories of diarrheagenic Escherichia coli

 

Desarrollo de PCR multiplex para detección y diferenciación de categorías de Escherichia coli diarreogénicos

 

 

Ana Roberta Fusco da Costa^I; Karla Valéria Batista Lima^II; Cintya Oliveira de Sousa^III; Edvaldo Carlos Brito Loureiro^III

^ILaboratório de Biologia Molecular, Seção de Bacteriologia e Micologia, Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil
^IILaboratório de Biologia Molecular, Seção de Bacteriologia e Micologia, Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil. Centro de Ciências Sociais e Educação, Universidade do Estado do Pará, Belém, Pará, Brasil
^IIILaboratório de Enteroinfecções Bacterianas, Seção de Bacteriologia e Micologia, Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil

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RESUMO

INTRODUÇÃO: As Escherichia coli diarreiogênicas (DEC) são consideradas importante causa de diarreia nos países em desenvolvimento. Para sua correta identificação, esses microrganismos devem ser diferenciados dos membros não patogênicos da microbiota intestinal. As DEC podem ser classificadas em seis categorias, de acordo com seu mecanismo de patogenicidade.
MATERIAIS E MÉTODOS: Foram desenvolvidos e avaliados dois sistemas de PCR multiplex para a detecção de E. coli enteropatogênicas (EPEC), enterotoxigênica (ETEC), enteroinvasora (EIEC) e produtora da toxina de Shiga (STEC).
RESULTADOS: Quatro categorias diarreiogênicas foram detectadas entre os isolados de E. coli obtidos de indivíduos infectados pelo HIV, com EIEC e EPEC representando os patótipos mais frequentes. Duas STEC stx1 e eae positivas foram identificadas, sendo este o primeiro relato de isolamento dessa categoria em indivíduos infectados pelo HIV no estado do Pará. A PCR multiplex mostrou-se como técnica eficiente, rápida e reprodutível para detecção dos isolados de DEC. Os dois sistemas de PCR multiplex apresentaram resultados 100% concordantes com os encontrados na PCR simples.
CONCLUSÃO: Devido sua simplicidade, economia e eficiência torna-se possível a aplicação dos protocolos multiplex para agilizar o diagnóstico molecular das categorias de DEC, o que promoverá a elaboração de novos projetos de pesquisa e darão suporte as atividades de vigilância epidemiológica desenvolvidos pelos institutos de saúde pública.

Palavras-chave: Reação em Cadeia da Polimerase; Escherichia coli; Fatores de Virulência; Enteropatias.

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ABSTRACT

INTRODUCTION: Diarrheagenic Escherichia coli (DEC) are considered an important cause of diarrhea in developing countries. The correct identification of these microorganisms depends on their differentiation from non-pathogenic members of the intestinal microbiota. DEC can be classified into one of six categories according to their mechanism of pathogenicity.
MATERIALS AND METHODS: Two multiplex PCR systems used to detect enteropathogenic (EPEC), enterotoxigenic (ETEC), enteroinvasive (EIEC) and Shiga Toxin-producing (STEC) E. coli were evaluated and described.
RESULTS: Four categories of DEC were detected among isolates of E. coli obtained from individuals infected with HIV. EIEC and EPEC were among the most prevalent pathotypes. Furthermore, two STEC strains that were both stx1-and eae-positive were identified. This is the first report of this kind of isolation in individuals infected with HIV in the State of Pará. Multiplex PCR proved to be an efficient, fast and reproducible technique for detection of DEC isolates. Both multiplex PCR systems described here produced results 100% similar to those obtained from individual PCR reactions.
CONCLUSION: Given their simplicity, cost and efficiency, it is possible to use these protocols to expedite the molecular diagnosis of the distinct categories of DEC. In addition to facilitating the development of new research projects, these findings could support the epidemiological surveillance undertaken by public health agencies and institutes.

Keywords: Polymerase Chain Reaction; Escherichia coli; Virulence Factors; Intestinal Diseases.

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RESUMEN

INTRODUCCIÓN: Las Escherichia coli diarreogénicas (DEC) son consideradas una importante causa de diarrea en los países en desarrollo. Para su correcta identificación, esos microorganismos deben ser diferenciados de los miembros no patogénicos de la microbiota intestinal. Las DEC pueden clasificarse en seis categorías, de acuerdo a su mecanismo de patogenicidad.
MATERIALES Y MÉTODOS: Se desarrollaron y evaluaron dos sistemas de PCR multiplex para la detección de E. coli enteropatogénicas (EPEC), enterotoxigénica (ETEC), enteroinvasora (EIEC) y productora de toxina Shiga (STEC).
RESULTADOS: Cuatro categorías diarreogénicas fueron detectadas entre los aislados de E. coli obtenidos de individuos infectados por HIV, con EIEC y EPEC representando los patotipos más frecuentes. Dos STEC stx1 y eae positivas fueron identificadas, siendo este el primer relato de aislamiento de esa categoría en individuos infectados por HIV en el estado de Pará. La PCR multiplex se mostró como técnica eficiente, rápida y reproductible para la detección de los aislados de DEC. Los dos sistemas de PCR multiplex presentaron resultados 100% concordantes a los encontrados en la PCR simple.
CONCLUSIÓN: Debido a su simplicidad, economía y eficiencia, se hace posible la aplicación de los protocolos multiplex para agilizar el diagnóstico molecular de las categorías de DEC, lo que promoverá la elaboración de nuevos proyectos de investigación y dará apoyo a las actividades de vigilancia epidemiológica desarrollados por los institutos de salud pública.

Palabras clave: Reacción en Cadena de la Polimerasa; Escherichia coli; Factores de Virulencia; Enfermedades Intestinales.

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INTRODUÇÃO

As Escherichia coli diarreiogênicas (diarrheagenic E. coli – DEC) representam importante causa de diarreia endêmica e epidêmica no mundo²⁹. Porém provavelmente a frequência desses patógenos é subestimada, devido sua detecção exigir métodos diagnósticos específicos que não são utilizados na prática clínica.

A identificação de E. coli diarreiogênica requer sua diferenciação das espécies não patogênicas da microbiota intestinal⁴³. As E. coli que causam diarreia são classificadas em categorias patogênicas de acordo com fatores de virulência específicos, codificados por cromossomos, plasmídios e DNA de bacteriófagos. Esses fatores de virulência fornecem a cada categoria uma capacidade de causar síndrome clínica com características epidemiológicas e patológicas distintas³⁸.

De acordo com seus mecanismos de patogenicidade as DEC podem ser classificadas em: E. coli enteropatogênica (EPEC); E. coli enterotoxigênica (ETEC); E. coli enteroinvasora (EIEC); E. coli produtora da toxina de Shiga (STEC); E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli difusamente aderente (DAEC)^29,42,48. Essas categorias podem ser eventualmente identificadas através de ensaios sorotípicos, fenotípicos e moleculares²⁹. O primeiro requer a identificação de antígenos somáticos (O) e flagelares (H). Na rotina laboratorial, é realizada apenas a pesquisa dos sorogrupos pela determinação dos antígenos somáticos. Este, porém, não é suficiente para identificar uma amostra como diarreiogênica, devido não estar correlacionado, em alguns casos, com a presença de fatores de virulência²⁴. Portanto, a identificação deve ser direcionada para as características que determinam a virulência desses microrganismos.

Os ensaios fenotípicos para a detecção de toxinas, padrão de aderência ou invasão podem identificar amostras de E. coli diarreiogênicas, porém requerem elevados investimentos, técnicas especiais e aplicação de vários sistemas de detecção (ex.: cultura de células, ensaios de citotoxidade), além de consumo de longo tempo^2,25. Com a aplicação da reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction – PCR) é possível detectar genes envolvidos com a patogenicidade de diversos isolados bacterianos, permitindo simples identificação³⁴.

Na investigação de patógenos a PCR é indicada para a amplificação de uma região específica do DNA que permite a detecção de determinado locus de virulência. Técnicas de PCR convencionais para a pesquisa de E. coli diarreiogênicas tem sido relatadas, porém, a investigação dos isolados bacterianos requer um grande número de reações individuais para a detecção de vários fatores de virulência, o que a torna laboriosa²⁰. Para reduzir o número de testes necessários para a identificação de DEC, vários sistemas de PCR de detecção múltipla (multiplex) para a amplificação simultânea de dois ou mais loci em uma única reação têm sido desenvolvidos^25,27,50. Entretanto, usualmente, mais de uma PCR multiplex é requerida⁴³. Para simplificar e diminuir o tempo para o diagnóstico diferencial, foram desenvolvidos neste estudo, sistemas de PCR multiplex aplicados para identificação das seguintes categorias de DEC, cujos marcadores de virulência já estão bem definidos: ETEC, EPEC, EIEC e STEC.

 

MATERIAIS E MÉTODOS

ISOLADOS BACTERIANOS

Este estudo incluiu 720 E. coli estocadas na bacterioteca da Seção de Bacteriologia e Micologia do Instituto Evandro Chagas (IEC), caracterizadas por métodos fenotípicos tradicionais como descrito previamente⁵. As E. coli foram isoladas de amostras fecais de 181 indivíduos maiores de 18 anos de idade infectados pelo HIV, durante os anos de 2000 a 2002. O projeto que deu origem a este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos do IEC sob parecer n^o 02/2000 em 26 de maio de 2000.

PCR

Para a investigação dos fatores de virulência, as amostras foram repicadas para tubos de ensaio com ágar TSI (Difco), incubadas a 37^o C por 24 h e posteriormente repicadas para tubos com ágar TSA (Difco) para extração do DNA. Para a extração do DNA bacteriano utilizou-se a técnica de termo-extração, tendo o crescimento bacteriano sido transferido para microtubos com 400 µL de água purificada esterilizada e submetido a 100^o C por 10 min. Após a fervura, a suspensão foi congelada a -20^o C. Depois dessa etapa, a suspensão foi descongelada e centrifugada a 13.000 rpm (16845xg) em microcentrífuga (mod. NT-805, Nova Técnica).

As categorias diarreiogênicas EPEC, ETEC, EIEC e STEC foram investigadas através de realização de PCR simples para sete diferentes marcadores moleculares, de acordo com condições estabelecidas em estudos anteriores (Quadro 1).

 

 

As E. coli diarreiogênicas foram classificadas conforme a presença de genes de fatores de virulência, de acordo com critérios previamente publicados (Quadro 2)⁷.

 

 

Cada reação apresentou volume final de 50 µl contendo 1 mM de deoxinucleotídeos (Invitrogen), 10 pmol de cada oligonucleotídeo (Invitrogen), 1,5 mM de MgCl (Invitrogen), tampão de Taq DNA polimerase 1× 2 (Invitrogen), 0,25 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen), e 3 µl de DNA. As condições de amplificação compreenderam desnaturação inicial a 94° C por 5 min, 35 ciclos com 1,5 min a 94^o C, 1,5 min a 50^o/56^o C e 1,5 min a 72^o C e extensão final por 10 min a 72° C. As reações foram realizadas em termociclador (mod. CE 3832, Thermo Hyband). Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose D-1 LE GQT a 2% (BioAmerica) contendo 1 µg/mL de brometo de etídeo (Sigma) e visualizados em transiluminador UVP (BioImaging Systems).

Para desenvolver os ensaios de PCR multiplex foram testadas várias temperaturas de anelamento, concentrações de reagentes e incorporação progressiva dos oligonucleotídeos. A sensibilidade e a especificidade da reação foram ensaiadas com as cepas de referências E2348/69 (EPEC), H10407 (ETEC LT-I/STa), EDL1284 (EIEC) e EDL933 (STEC). A cepa de E. coli K12 foi usada como controle negativo. Os oligonucleotídeos utilizados estão descritos no quadro 1.

 

RESULTADOS

Para identificação simultânea e diferenciação de quatro categorias diarreiogênicas de E. coli foram desenvolvidos dois sistemas de PCR multiplex (Sistemas 1 e 2) contendo, respectivamente, três e quatro pares de iniciadores (Quadro 3).

 

 

Quando os pares de oligonucleotídeos foram incorporados nos sistemas multiplex, uma interferência foi observada. Este foi o caso de LT-1/LT-2 que sob a concentração de 10 pmol/µL inibiu a amplificação de eae. Nesta situação, a modificação da concentração de LT- 1/LT-2 para 5 pmol/µL foi suficiente para favorecer a amplificação do alvo esperado (eae).

Apenas os loci alvos foram detectados nos controles positivos, sem que houvesse o aparecimento de amplificações inespecíficas. Como controle positivo dos sistemas de PCR multiplex foi utilizada uma mistura contendo o DNA das cepas de referência, observando-se reprodutibilidade com os resultados obtidos na PCR simples. As amplificações visualizadas nos sistemas 1 e 2 de PCR multiplex estão demonstradas na figura 1.

 

 

A especificidade dos produtos obtidos nas reações de PCR multiplex foi determinada pelo estudo das amostras de referência. Para validação dos sistemas de PCR multiplex desenvolvidos e demonstração da utilidade diagnóstica, foram analisados os 78 isolados caracterizados por PCR simples como DEC e o triplo de amostras (234 isolados) com resultados de PCR negativos, compreendendo o total de 312 testes.

Dentre as 720 E. coli testadas por PCR simples 78 (10,8%) apresentaram um ou mais genes característicos de DEC, sendo identificadas em: EIEC (n = 34), EPEC (n = 29), ETEC (n = 13) e STEC (n = 2). Das 29 EPEC encontradas 28 foram classificadas como EPEC atípicas, pela ausência do gene bfpA (fímbria BFP). As 13 ETEC foram caracterizadas como LT-I (n = 2) e STa (n = 11). Um total de 34 isolados pertencia a categoria EIEC. Duas STEC foram identificadas, sendo stx1 e eae positivas. Na análise comparativa dos dados obtidos foi encontrada concordância 100% entre os resultados de PCR simples e multiplex.

 

DISCUSSÃO

Algumas DEC são geneticamente diferenciadas das demais pela presença de genes codificantes de fatores de virulência específicos que têm sido utilizados na identificação^6,7,29,35,39. Dentre esses, a detecção simultânea de múltiplos genes de virulência através de ensaios de PCR multiplex tem sido executada^4,36,41. Para reduzir o número de PCR realizadas, nós desenvolvemos dois sistemas de PCR multiplex para detecção de sete genes de fatores de virulência, característicos de quatro patótipos: EPEC, ETEC, EIEC e STEC. Embora sejam conhecidas seis linhagens de E. coli diarreiogênicas, somente aquelas quatro apresentam marcadores de virulência bem definidos²⁹.

Alguns estudos têm sugerido alvos moleculares para caracterização de EAEC, como os genes setBA, aaiA, astA e aat. Entretanto, observou-se que alguns destes marcadores não são exclusivos dessa categoria^17,19. Os genes afa, dra e daa, codificadores de uma família de adesinas, têm sido utilizados para caracterização de DAEC, porém os mesmos podem estar presentes em E. coli não patogênicas²². Portanto, devido a essas peculiaridades, recomenda-se a inclusão de ensaios de aderências em cultura de células HEp-2 ou HeLa como método padrão-ouro para definição das categorias EAEC e DAEC²⁹.

São crescentes as descrições de sistemas de PCR para identificação simultânea de múltiplos loci. Pass et al³³ realizaram PCR multiplex para detecção de 11 diferentes fatores de virulência, entretanto utilizaram quatro sistemas, o que representa pouca praticidade. Nguyen et al³¹ apresentaram um ensaio de PCR multiplex para detecção de oito genes característicos de EPEC, ETEC, EIEC, STEC e EAEC, porém com baixa resolutividade entre ETEC-LT e EIEC (diferenças de 2 pb entre os fragmentos característicos dessas categorias). Müller et al²⁸ também desenvolveram um sistema de PCR multiplex para identificação de DEC, no entanto aplicado apenas às categorias EPEC e EIEC.

Outros estudos relataram o uso de PCR multiplex para identificação de vários patótipos^{6,20,30,43,48}. Entretanto, apresentam como limitação a inabilidade de diferenciar todas as categorias de DEC, principalmente em infecções mistas de por EPEC atípicas e STEC, tornando necessária a realização de outras PCR para verificação dos resultados.

Neste estudo foram desenvolvidos dois sistemas de PCR multiplex de rápida otimização, simples execução, fácil implantação na rotina de laboratórios de referência, baratos – quando comparados aos sistemas de PCR que utilizam marcadores fluorescentes – e que dispensam a realização de PCR adicionais para esclarecimento dos resultados, como por exemplo, na presença de patótipos que compartilhem marcadores de virulência. O método permitiu a identificação de quatro categorias diarreiogênicas, representando 10,8% dos isolados, com predomínio de EIEC seguido de EPEC, com maior prevalência da subcategoria atípica.

As EIEC são capazes de invadir a mucosa intestinal causando ocasionalmente quadro de disenteria. Estudos relatam a incidência muito baixa para essa categoria, sendo a maior ocorrência relacionada a surtos e entre crianças de países em desenvolvimento^{13,14,15,23,26}. Investigações realizadas no Brasil sobre enteropatógenos envolvidos com diarreia infantil demonstraram baixa frequência de EIEC^11,37, contrastando com os achados deste estudo. Entretanto, tal diferença pode estar associada à faixa etária e população pesquisada, sendo que naqueles estudos foram investigadas crianças e, no presente trabalho, se avaliou isolados provenientes de indivíduos adultos infectados pelo HIV. Em estudo com indivíduos infectados pelo HIV no Senegal, o patótipo EIEC representou a segunda categoria de E. coli mais prevalente¹², semelhante ao encontrado neste trabalho.

Dos 29 isolados de EPEC, 28 foram classificados como EPEC atípicas. A divisão de amostras de EPEC em típicas e atípicas tem importante implicação clínico-epidemiológica, antes não valorizada. Por muitos anos, alguns sorotipos de EPEC típicas associados à diarreia infantil foram isolados com frequência, mas tem sido observada a redução desta subcategoria e um aumento relativo do isolamento de EPEC atípicas em muitos países^{1,18,21,40,45,46,49}. Alguns trabalhos sugerem que as EPEC atípicas sejam tão patogênicas quanto às típicas, embora tenha sido relatado que a diarreia provocada por essa subcategoria seja mais branda⁵¹. Há registros também de que as EPEC atípicas estejam mais significativamente associadas à diarreia endêmica ou como causa de surtos^9,10,51.

Duas STEC stx1 e eae positivas foram identificadas. As infecções devido a STEC são relatadas em casos esporádicos no Brasil^3,6,11,16, sendo este o primeiro relato de isolamento dessa categoria em indivíduos infectados pelo HIV no Estado do Pará.

 

CONCLUSÃO

Os resultados deste estudo demonstraram a diversidade de patótipos de E. coli isolados de indivíduos infectados pelo HIV, com predomínio de EIEC e EPEC atípicas. Os sistemas de PCR multiplex mostraram-se como metodologia simples, econômica e eficiente para rápida triagem e identificação de isolados de DEC, e desta forma podem ser incorporados à rotina de laboratórios de referência, dando suporte às atividades de vigilância epidemiológica desenvolvidas pelos institutos de saúde pública.

 

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Correspondência / Correspondence / Correspondencia:
Ana Roberta Fusco da Costa
Laboratório de Biologia Molecular, Seção de Bacteriologia e Micologia
Instituto Evandro Chagas
BR 316, km 7, 67030-000 Ananindeua-Pará-Brasil
Telefone: 55 91 3214-2116 / Fax: 91 3214-2114
E-mail: anacosta@iec.pa.gov.br / robertafusco@gmail.com

Recebido em / Received / Recibido en: 31/7/200
Aceito em / Accepted / Aceito en: 22/9/2010