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INTRODUÇÃO
Fungos são organismos eucarióticos, heterotróficos, unicelulares ou pluricelulares, amplamente distribuídos na natureza, encontrados no ar atmosférico, no solo, na água, nos vegetais, em detritos em geral, nos alimentos, no homem e em outros animais1,2,3,4. A disseminação desses microrganismos pode ocorrer sob várias formas. Quando essa propagação se dá pelo ar, são denominados de fungos anemófilos ou fungos alergizantes, cujos esporos são aeroalérgenos, responsáveis por manifestações respiratórias, que podem assumir caráter oportunista em hospedeiros imunocomprometidos ou submetidos à alta exposição1,4.
A concentração de fungos anemófilos no ambiente depende de vários fatores, dentre esses se destacam o tipo de climatização de ambientes fechados, intensidade de atividade humana e outros aspectos ambientais, tais como correnteza de ar, precipitação pluviométrica, pressão barométrica, nebulosidade, temperatura, umidade relativa do ar e incidência de raios solares2,5. Em bibliotecas, o ambiente torna-se propício à propagação de microrganismos, especialmente fungos anemófilos, devido as suas condições especiais de ventilação/climatização, umidade e temperatura3,6.
Estudos sobre a micobiota anemófila de bibliotecas mostram uma ampla variedade de fungos, incluindo aqueles potencialmente patogênicos, cuja presença representa um risco ocupacional e pode desencadear manifestações alérgicas em seus frequentadores3,4,6. Sabe-se que indivíduos confinados em ambientes fechados, com ventilação e climatização artificiais, a exemplo de salas de aula, bibliotecas, teatros, cinemas e outros, podem apresentar sintomas persistentes, que incluem dores de cabeça, prurido, irritação e edema ocular e das mucosas, desconforto na orofaringe e mal-estar geral4, comprometendo a qualidade de vida desses.
Devido a esses fatos, boas práticas de limpeza e higienização ambiental são implementadas em muitas bibliotecas por meio de medidas simples, como o uso de pincéis, flanelas (secas) ou até mesmo aspirador de pó3. O ar desses ambientes, sobretudo ao se considerar as características dos fungos anemófilos, é mais afetado, podendo apresentar maior número de unidades formadoras de colônias (UFC) quando comparado com superfícies e livros6. Entretanto, apesar da existência de normas de higienização ambiental, há poucos estudos e iniciativas de atenção à qualidade do ar dessas unidades4,7.
Nesse contexto, há a necessidade de consolidação de informações sobre os fungos anemófilos, o aumento de estudos sobre microrganismos com potencial alergênicos e a busca de indicadores ambientais, como a presença desses fungos. No caso de bibliotecas, em particular, o interesse surge das implicações para a conservação de livros e quanto à condição de saúde de trabalhadores e frequentadores, considerando que os problemas de saúde mais reportados por trabalhadores desse serviço estão relacionados a mecanismos alérgicos8,9. Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar a ocorrência de fungos anemófilos em bibliotecas de instituições de ensino de nível básico e superior da cidade de Maceió, estado de Alagoas, Brasil.
MATERIAIS E MÉTODOS
CARACTERIZAÇÃO DO AMBIENTE E COLETA DAS AMOSTRAS
As amostras foram colhidas em bibliotecas de duas instituições de ensino superior, sendo uma pública e uma privada (espaços A e C), ocupando uma área geográfica de 1.560 m2 e 730 m2, respectivamente, e em uma biblioteca de um complexo de escolas públicas de nível fundamental e médio (espaço B), com área de 850 m2, localizadas em Maceió. Os ambientes das instituições de nível superior possuíam condicionadores de ar de 12.000 BTU, enquanto na instituição de nível médio e fundamental havia somente ventiladores de teto.
Conforme a observação dos pesquisadores, as três bibliotecas apresentavam iluminação artificial, sem incidência de luz solar, e a higienização dos pisos ocorria diariamente, utilizando saneantes domissanitários. Além disso, com o auxílio de um pano úmido, era feita a remoção diária de poeira de balcões de madeira, mesas, cadeiras, armários, arquivos, carrinhos de transporte de livros, persianas, caixilhos das janelas e computadores. A limpeza das capas dos livros era realizada trimestralmente no espaço C e semestralmente nos espaços A e B, utilizando algodão umedecido em álcool ou acetato de etila. As estantes eram higienizadas com pano levemente umedecido em álcool, tendo-se o cuidado para não molhar os livros. No espaço C, além da limpeza descrita anteriormente, a remoção do pó era feita por aspirador a cada dois meses.
No momento das coletas, foram realizadas medições de temperatura e umidade relativa do ar de cada ambiente com termo-higrômetro digital. Para a coleta de fungos anemófilos, foi utilizada a técnica de sedimentação de esporos, que consiste na exposição de placas de Petri contendo meio de cultivo a altura de 1,2 m a partir do solo por 30 min10. Desse modo, foram realizadas exposições de 55 placas de Petri de 90 mm contendo ágar Sabouraud dextrose (ASD), acrescido de cloranfenicol na concentração de 50 mg/L, em locais estratégicos de acesso constante, como mesas, estantes e balcões, levando-se em consideração a dimensão do ambiente e uma equidistância entre uma placa e outra de 8,5 m. Respeitando essa equidistância, 15 placas foram expostas em cada um dos espaços B e C, e 25 placas no espaço A. No espaço A, de 1.560 m2, considerou-se dimensões iguais de 39,5 x 39,5 m, cuja distância no eixo X foi de 8,75 m e em Y de 9,7 m, o que padronizou a equidistância de 8,5 m entre as placas, de forma a respeitar o tráfego de usuários e funcionários. O mesmo raciocínio foi empregado para os espaços B e C, com área de 850 m2 e 730 m2, respectivamente, com dimensões de 29,1 m x 29,1 m e de 27 m x 27 m, para a distribuição das 15 placas. Transcorrido o tempo de exposição, as placas foram devidamente etiquetadas, acondicionadas e transportadas ao Laboratório de Micologia do Centro Universitário Cesmac, onde foram incubadas à temperatura ambiente (28 ± 2 ºC) e observadas diariamente por um período de sete dias.
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS
Após constatação de crescimento fúngico nas placas, foi realizada a análise quantitativa por meio da contagem do número de UFC, diferenciando-as em leveduriformes e filamentosas.
Para o isolamento dos fungos, inicialmente, foi realizada a purificação por meio da transferência de fragmentos de colônias para o preparo de uma suspensão em água destilada esterilizada e, em seguida, a semeadura por esgotamento em placas de Petri contendo ASD adicionado de cloranfenicol (50 mg/L). As placas foram mantidas à temperatura ambiente (28 ± 2 ºC) para o desenvolvimento de colônias isoladas. Constatado o crescimento, essas colônias foram transferidas para tubos de ensaio contendo ágar batata dextrose para manutenção e posterior identificação11,12,13.
A identificação dos fungos filamentosos baseou-se na associação das características macro e micromorfológicas da cultura. As características macroscópicas, como textura, formato e coloração no verso e reverso da colônia, juntamente com as características microscópicas, tais como estruturas reprodutivas e outras, como clamidósporos, hifas (presença ou ausência de septos), coloração das hifas e dos esporos (hialinos ou demáceos), foram comparadas aos critérios adotados por Hoog et al.11, Lacaz et al.12, Sidrim e Rocha13, Zaitz et al.14 e Mezzari e Fuentefria15. Para melhor identificação e visualização das estruturas dos fungos filamentosos, foi feito o microcultivo em lâmina, pela técnica descrita por Riddell16, utilizando ágar Lactrimel para estimular a esporulação.
Para identificação dos fungos leveduriformes, foram realizadas as análises macromorfológica das colônias e microscópica pela técnica de microcultivo em ágar fubá. O resultado foi associado ao teste de tubo germinativo, formação de clamidósporos em ágar Tween 80 (Difco) e ao padrão de assimilação e fermentação de diversas fontes de carbono e nitrogênio14.
RESULTADOS
No momento da exposição das placas, foram observados registros térmicos de 24,6 °C, 28,1 °C e 21,6 °C e umidade de 68%, 69% e 59% nos acervos A, B e C, respectivamente, que originaram 55 amostras no total (Tabela 1).
Tabela 1 - Registro de temperatura e umidade do ambiente, no momento de exposição das placas, e número de amostras obtidas nas bibliotecas A, B e C da cidade de Maceió, estado de Alagoas, Brasil
| Biblioteca | Parâmetros termo-higrométricos | Número de amostras | % | |
|---|---|---|---|---|
| Temperatura ºC | URA | |||
| A | 24,6 | 68 | 25 | 45,4 |
| B | 28,1 | 59 | 15 | 27,3 |
| C | 21,6 | 69 | 15 | 27,3 |
| Total | 55 | 100,0 | ||
URA: Umidade relativa do ar.
Nas 55 amostras analisadas, foram obtidas 351 UFC, das quais 331 UFC (94,3%) eram fungos filamentosos e 20 UFC (5,7%) fungos leveduriformes. A contagem global de colônias nos acervos bibliográficos A, B e C resultou em 212 (60,4%), 123 (35,0%) e 16 (4,6%) UFC, respectivamente, conforme tabela 2.
Tabela 2 - Ocorrência de UFC de fungos filamentosos e leveduriformes nas bibliotecas A, B e C da cidade de Maceió, estado de Alagoas, Brasil
| Bibliotecas | Fungos | Total | % | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Filamentosos | Leveduriformes | |||||
| FA (UFC) | FR (%) | FA (UFC) | FR (%) | |||
| A | 198 | 56,4 | 14 | 4,0 | 212 | 60,4 |
| B | 118 | 33,6 | 5 | 1,4 | 123 | 35,0 |
| C | 15 | 4,3 | 1 | 0,3 | 16 | 4,6 |
| Total | 331 | 94,3 | 20 | 5,7 | 351 | 100,0 |
FA: Frequência absoluta; FR: Frequência relativa.
A biblioteca A apresentou maior contagem de UFC, tanto de fungos filamentosos quanto de leveduriformes. Em relação à identificação dos fungos, observou-se uma maior ocorrência de Penicillium sp. (115 UFC), seguido por Cladosporium sp. (79 UFC), Alternaria sp. (20 UFC), Aspergillus sp. (20 UFC) e Curvularia sp. (18 UFC). A maior diversidade fúngica foi verificada na biblioteca A, registrando 15 gêneros, sendo Cladosporium sp. (69 UFC) o fungo predominante, seguido por Penicillium sp. (32 UFC) e Curvularia sp. (16 UFC). Na biblioteca B, onde não havia climatização, o gênero de maior ocorrência foi Penicillium sp. (80 UFC), enquanto na biblioteca C predominou o gênero Aspergillus sp. (6 UFC). Não foram identificados 13,9% (49 UFC) dos fungos devido à ausência de estruturas reprodutivas (Tabela 3).
Tabela 3 - Microbiota fúngica anemófila identificada nas bibliotecas A, B e C da cidade de Maceió, estado de Alagoas, Brasil
| Gêneros/ Espécies | Bibliotecas | Total | % | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| A | B | C | ||||||
| FA (UFC) | FR (%) | FA (UFC) | FR (%) | FA (UFC) | FR (%) | |||
| Acremonium sp. | 2 | 0,6 | - | - | 2 | 0,6 | 4 | 1,2 |
| Alternaria sp. | 15 | 4,3 | 5 | 1,4 | - | - | 20 | 5,7 |
| Aspergillus sp. | 14 | 4,0 | - | - | 6 | 1,7 | 20 | 5,7 |
| Bipolaris sp. | 2 | 0,6 | - | - | - | - | 2 | 0,6 |
| Cladosporium sp. | 69 | 19,6 | 8 | 2,3 | 2 | 0,6 | 79 | 22,5 |
| Curvularia sp. | 16 | 4,6 | 2 | 0,6 | - | - | 18 | 5,2 |
| Fonsecaea sp. | 5 | 1,4 | - | - | - | - | 5 | 1,4 |
| Fusarium sp. | 10 | 2,8 | - | - | - | - | 10 | 2,8 |
| Mycelia sterilia | - | - | 1 | 0,3 | - | - | 1 | 0,3 |
| Neurospora sp. | 1 | 0,3 | - | - | - | - | 1 | 0,3 |
| Nigrospora sp. | - | - | 1 | 0,3 | - | - | 1 | 0,3 |
| Penicillium sp. | 32 | 9,1 | 80 | 22,7 | 3 | 0,8 | 115 | 32,6 |
| Rhodotorula sp. | 5 | 1,4 | 1 | 0,3 | 1 | 0,3 | 7 | 2,0 |
| Scopulariopsis sp. | 3 | 0,9 | - | - | - | - | 3 | 0,9 |
| Trichosporon sp. | 7 | 2,0 | 2 | 0,6 | - | - | 9 | 2,6 |
| Ulocladium sp. | 4 | 1,1 | - | - | - | - | 4 | 1,1 |
| Veronaea sp. | 2 | 0,6 | 1 | 0,3 | - | - | 3 | 0,9 |
| Não identificados | 25 | 7,1 | 22 | 6,2 | 2 | 0,6 | 49 | 13,9 |
| Total | 212 | 60,4 | 123 | 35,0 | 16 | 4,6 | 351 | 100,0 |
UFC: Unidade formadora de colônia; FA: Frequência absoluta; FR: Frequência relativa. Sinal convencional utilizado: - Dado numérico igual a zero, não resultante de arredondamento.
Diversas culturas fúngicas foram obtidas após a coleta das amostras por sedimentação espontânea nas três bibliotecas estudadas. Na figura 1, estão apresentados os aspectos macroscópicos e microscópicos dos seis fungos mais prevalentes e que exibiram mais de 10 UFC nos ambientes avaliados, sendo esses representados por Alternaria sp., Aspergillus sp., Cladosporium sp., Curvularia sp., Fusarium sp. e Penicillium sp.
A: Alternaria sp.; B: Aspergillus sp.; C: Cladosporium sp.; D: Curvularia sp.; E: Fusarium sp.; F: Penicillium sp. Lâminas coradas com lactofenol azul-algodão.
Figura 1 - Aspectos macroscópicos e microscópicos dos fungos que apresentaram maior prevalência no ambiente das bibliotecas A, B e C, cultivados em placas de Petri contendo ágar batata dextrose a 28 ºC, na cidade de Maceió, estado de Alagoas, Brasil
As limitações deste estudo estão relacionadas à quantidade de espaços estudados e à falta de estrutura para realizar a identificação molecular desses fungos.
DISCUSSÃO
Os resultados obtidos neste estudo assemelham-se aos relatados por Menezes et al.17, no que se refere à diversidade fúngica encontrada, já que obtiveram 220 UFC a partir de 50 exposições em uma biblioteca climatizada de uma instituição pública de ensino superior no nordeste do Brasil. Ambientes fechados climatizados tendem ao acúmulo de células fúngicas dispersas no ar, como evidenciado por Ribeiro e Lubisco6, ao compararem a concentração de UFC de ambiente interno com o externo de uma biblioteca, onde o primeiro apresentou aproximadamente o dobro de concentração de UFC que o segundo.
As bibliotecas são espaços que propiciam condições ideais para o crescimento de microrganismos, uma vez que concentram grande quantidade de matéria orgânica, incluindo papel, cola de amido, couro e tecidos18. Por isso, evidências apontam que, mesmo em condições controladas, há contaminação por fungos em superfícies e no ar desses ambientes19.
No espaço C, foi observado um menor número de UFC e espécies de fungos filamentosos quando comparado à biblioteca A, que também é climatizada. Esse fato pode estar relacionado à sistematização da limpeza desse local e menor temperatura e umidade verificada no momento da coleta. A biblioteca C adotava práticas regulares de limpeza e higienização; além disso, o ambiente apresentava melhor refrigeração, especialmente por possuir menor fluxo de pessoas no local, observação feita durante o período do estudo, quando comparado à biblioteca A, que oferecia 88 cursos presenciais, e a C, 13 cursos e ser constituída por uma área menor. Assim, a maior frequência de fungos no espaço A pode estar relacionada à maior visitação nesse espaço por alunos e funcionários, visto que essa biblioteca serve de referência para outras instituições de ensino e pesquisa do estado. Ademais, é importante considerar que os equipamentos de climatização são frequentemente desligados no período noturno e aos fins de semana nessa biblioteca, o que causa uma variabilidade de temperatura, sobretudo em decorrência das amplitudes térmicas experimentadas na Região Nordeste.
O espaço B, segundo em número de UFC e diversidade fúngica, não possuía equipamentos de climatização, sendo observada a maior temperatura registrada durante a coleta. Além disso, as baixas taxas de circulação de ar em ambientes internos podem ocasionar um aumento considerável na concentração de poluentes biológicos do ar20. Pantoja et al.21 esclarecem que o crescimento de fungos ocorre de maneira mais rápida quando a umidade relativa do ar está acima da taxa de 65%, também evidenciado nos ambientes A e B. Segundo Pereira e Lemos22, a temperatura exerce uma função primordial tanto sobre o crescimento, germinação e esporulação dos fungos como também sobre o seu metabolismo.
Fatores como higienização, temperatura e luminosidade estão diretamente relacionados à maior diversidade fúngica20. A limpeza inadequada, com uso de métodos que facilitam a dispersão aérea de microrganismos, por exemplo, pode contribuir para esse fato, como ocorre com o uso de vassouras. É importante considerar que a diversidade fúngica relatada neste estudo pode estar relacionada às ineficientes condições de higienização e climatização, que variam em cada espaço estudado21, sendo observada maior prevalência de fungos nas bibliotecas de instituições públicas.
A fim de evitar ou diminuir a proliferação de fungos e outros microrganismos em bibliotecas, é recomendada a prática da limpeza regular, proporcionando a conservação do acervo, a manutenção da qualidade do ar e, consequentemente, preservando a saúde dos seus frequentadores. A higienização corresponde principalmente à retirada de material particulado (poeira, pólen, escamas de pele humana, pelos, entre outros) dos documentos e superfícies do ambiente, devendo ser realizada periodicamente, com o uso de técnicas apropriadas6. O espaço físico das bibliotecas deve ser suficientemente arejado, iluminado e apresentar valores de temperatura (entre 20 e 23 ºC) e umidade (55 a 65%) adequados à preservação de livros e documentos21. Além disso, torna-se essencial a higienização mensal dos filtros dos condicionadores de ar nos acervos que dispõem de climatização, a fim de diminuir o crescimento de microrganismos, uma vez que o acúmulo de umidade e material orgânico nesses equipamentos pode torná-los poderosas fontes dispersoras de patógenos23,24.
No que concerne à variabilidade de espécies fúngicas, estudos publicados corroboram com os resultados obtidos nesta pesquisa, pois as coletas realizadas ao longo dos anos em espaços internos de bibliotecas mostraram que, entre os fungos que contaminam esses espaços, predominam espécies do gênero Aspergillus e Penicillium8,17,20. No presente estudo, as espécies de fungos filamentosos mais frequentes foram Penicillium sp. e Cladosporium sp.; entretanto, Alternaria sp., Aspergillus sp. e Curvularia sp. também apresentaram frequência superior às outras espécies identificadas.
Estudos ambientais realizados nos últimos 20 anos com ar dos ambientes de bibliotecas evidenciaram que espécies de Cladosporium, Aspergillus e Penicillium são quase onipresentes e podem produzir numerosos conídios que são facilmente dispersados pelo ar25. Segundo Martins26, a diversidade de fungos presente em ambientes fechados é resultante da disseminação ocasionada pelas correntes de ar, entre outros fatores bióticos do ambiente externo, e está relacionada especialmente ao aparecimento de gêneros característicos da microbiota local de determinada região.
Nesse sentido, espécies pertencentes aos gêneros Aspergillus, Penicillium e Verticillium apresentam atividade celulolítica, sendo capazes de deteriorar materiais ricos em celulose, tais como madeira, livros e quadros27. Além do mais, os gêneros de fungos que são encontrados com maior frequência no ar são Aspergillus sp., Penicillium sp., Fusarium sp., Cladosporium sp., Curvularia sp., Neurospora sp. e Alternaria sp., sendo Aspergillus e Penicillium considerados os colonizadores primários de superfícies e interiores28.
Em relação aos fungos filamentosos identificados neste estudo, grande parte desses microrganismos está comumente associada a processos patológicos. Fungos anemófilos, quando inalados, podem desencadear doenças que vão desde manifestações alérgicas respiratórias, tais como asma e rinite, até infecções graves em indivíduos imunocomprometidos20.
Entre essas espécies, fungos do gênero Aspergillus causam maior preocupação, por poder ocasionar desde reações alérgicas até aspergilose, doença caracterizada por um quadro clínico broncopulmonar e que pode se disseminar, comprometendo diversos órgãos20. A aspergilose invasiva está relacionada a uma diversidade de cenários clínicos, comumente variável em relação às manifestações, apresentando uma taxa de mortalidade muito elevada29.
Embora as espécies de Penicillium sejam saprófitas, ubíquas do solo e, consequentemente, sobrevivam de substâncias orgânicas biodegradáveis e prefiram climas frios a moderados, sua colonização está relacionada à capacidade de crescimento em uma variedade de temperaturas, habilidade de sobreviver em diferentes faixas de atividade de água e condições físico-químicas, as quais são encontradas em bibliotecas, tornando esse ambiente propício para a sua dispersão30.
Além disso, Cladosporium tem sido o gênero fúngico mais comum em diversos estudos de ambientes internos climatizados, sendo considerado um fungo dominante universal31,32,33,34,35,36. Muitas espécies de Cladosporium são reconhecidas como patógenos emergentes, responsáveis por infecções pulmonares, cutâneas e problemas relacionados ao sistema respiratório, frequentemente associados a queixas asmáticas37,38.
Em menor frequência, foi observada a presença de fungos leveduriformes nos ambientes de estudo. Embora tenha sido relatado o isolamento desses fungos, pouca atenção é dada aos mesmos, quando comparados aos fungos filamentosos responsáveis por desencadear processos alérgicos de forma iminente, a exemplo do Aspergillus, enquanto fungos leveduriformes não produzem reações alérgicas ou respiratórias de imediato, embora possam ser danosos a indivíduos com imunocomprometimento8. É importante ressaltar que podem estar relacionados a infecções superficiais e sistêmicas, especialmente naqueles indivíduos com comprometimento do sistema imunológico39.
Entre as espécies leveduriformes isoladas, Trichosporon sp. apresentou maior frequência, com 9 UFC (2,6%). Trichosporon é um fungo que pode fazer parte da microbiota normal da pele humana e trato gastrointestinal, e 17 espécies desse gênero são clinicamente relevantes40,41,42 por serem causadoras de piedra branca, pneumonite por hipersensibilidade e vários tipos de infecções invasivas, principalmente em indivíduos imunocomprometidos41, sendo, portanto, considerado oportunista.
Outra levedura identificada foi Rhodotorula sp., considerada comensal e que está presente nas vias respiratórias, microbiota gastrointestinal e genital humana e disseminada no meio ambiente. Pode causar infecções oportunistas em pacientes imunocomprometidos, as quais variam de endocardite, meningite, ventriculite e peritonite, até casos de fungemia potencialmente fatais43,44,45.
Os resultados deste estudo demonstram a necessidade da melhoria das medidas de desinfecção ambiental para manutenção do acevo de bibliotecas e prevenção de doenças ocasionadas por fungos em seus frequentadores.
CONCLUSÃO
Os resultados deste estudo evidenciam a importância de rotinas de desinfecção ambiental em espaços fechados, como as bibliotecas, para a prevenção de doenças em seus frequentadores e a conservação do acervo, visto que o risco à saúde pode ser maior ou menor, dependendo das medidas de controle ambiental adotadas, da frequência da higienização do acervo e do ambiente em geral, do monitoramento da temperatura e da umidade relativa do ar.
