ARTÍCULO ORIGINAL

Potencial anti-Leishmania y inmunomodulador de extracto de Campsiandra laurifolia Benth. (Fabaceae)

Anadeiva Portela Chagas^I; Adolfo Henrique Müller^II; Milene Soares^III; Lourdes Maria Garcez^IV

^IInstituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil
^IIUniversidade Federal do Pará, Belém, Pará, Brasil. Centro Universitário do Pará, Belém, Pará, Brasil
^IIICentro de Pesquisa Gonçalo Muniz/FIOCRUZ, Salvador, Bahia, Brasil
^IVInstituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil. Universidade do Estado do Pará, Belém, Pará, Brasil

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Correspondence

Título original: Potencial anti-Leishmania e imunomodulador dos extratos de Campsiandra laurifolia Benth. (Fabaceae). Traducido por: Rocio Tamara (resumen) y Lota Moncada (artículo)

RESUMEN

Las infusiones de las hojas, cortezas y semillas de Campsiandra laurifolia Benth. (Fabaceae) son utilizadas por las comunidades de descendientes de esclavos negros (denominados quilombos) para el tratamiento, principalmente, de la Leishmaniasis cutánea (LC), de heridas en la piel, de úlceras e impétigo. Se investigó con extractos hidroalcohólicos y acuosos de C. laurifolia la actividad anti-Leishmania en promastigotes de Leishmania (L.) amazonensis y la respuesta inmunomoduladora: proliferación celular de esplenocitos y producción de ON por macrófagos peritoneales de ratones BALB/c. Los extractos hidroalcohólicos de la corteza y acuosos de la hoja y de la semilla presentaron una menor actividad frente a las formas de amastigotes y promastigotes (<20%) y el mismo se observó para la inhibición de la producción de ON por los macrófagos activados (<23%). La mayoría de los extractos presentaron un moderado potencial inmunosupresor (de 32,6% a 38,5%), pero los extractos acuosos de la semilla (AS) inhiben hasta un 87% el crecimiento de esplenocitos BALB/c estimulados con mitógenos. Esa actividad puede explicar la indicación de los descendientes de quilombos (quilombolas) del uso de C. laurifolia para el tratamiento de LC, ya que su uso puede no estar asociado principalmente con una acción directa sobre el parásito, sino con una actividad inflamatoria, pues esa actividad disminuye el daño tisular causado por el sistema inmunológico en respuesta a la infección y, en consecuencia, ayuda en la cicratización de las lesiones ocasionadas por la Leishmaniasis.

Palabras clave: Fitoterapia; Extractos Vegetales; Fabaceae; Leishmaniasis; Inmunosupresión.

INTRODUCCIÓN

Las leishmaniasis constituyen un complejo de enfermedades que alcanzan al hombre, iniciadas por la inoculación de las especies del género Leishmania durante el repasto sanguíneo de insectos vectores^20,7,9. Entre ellas, la leishmaniasis cutánea (LC) es particularmente importante en América del Sur por presentar aspecto de cronicidad, latencia y por desarrollar metástasis que conducen a cuadros clínicos desfigurantes. En el tratamiento de esa enfermedad, la quimioterapia con antimoniales pentavalentes es extensamente utilizada, pero, efectos adversos, administración parenteral, tratamientos prolongados y aparecimiento de resistencia justifican la búsqueda de drogas alternativas más eficaces^10,21.

Varias clases de substancias ya han sido aisladas, tales como alcaloides, ligninas, neoligninas, terpenos y ácido benzoico, y se han mostrado bioactivas⁶. Sin embargo, entre 97 sustancias levantadas en el trabajo de Chan-Bacab y Peña-Rodriguez⁴, apenas 2-n-propylquinoline, alcaloide de las hojas de Galipea longiflora (Rutaceae), está en fase clínica para el tratamiento de la LC^9,10, pues la mayoría de las sustancias ensayadas, in vivo, presenta altos niveles de citotoxicidade y baja actividad cuando administradas en dosis moderadas^4,2. No obstante, esos esfuerzos deben de ser continuados, pues la gran variabilidad de linajes de Leishmania y el aparecimiento de formas resistentes, llevan a la necesidad de desarrollo de diferentes tipos de drogas¹⁰.

La especie Campsiandra laurifolia Benth., una leguminosa de la familia Fabaceae, se encuentra en Brasil, principalmente en los Estados de Pará, Amapá y Amazonas, en áreas de igapó y en los márgenes de igarapés y ríos. El Manaiara, como es conocida popularmente, se utiliza principalmente para el tratamiento de heridas, empeine, malaria, úlcera²³. La comunidad de Arancuá, uno de los 27 remanentes de quilombos (descendientes de negros que resistieron a la esclavitud) de esa región, que queda al margen del río Trombetas, próximo al Municipio de Oriximiná, al Oeste del Estado de Pará, frecuentemente se exponen al vectorde la LC, durante tres meses del año (enero a marzo). En esa época, sus integrantes residen en áreas de selva, para realizar la colecta anual de castaña-de-Pará¹. Esa comunidad utiliza la infusión de las hojas y la tapioca del fruto (parte amilácea obtenida a partir de la maceración acuosa y secado en exposición a la luz solar) para el tratamiento de la leishmaniasis cutánea³. El uso popular, el gran número de indicaciones y la ausencia de estudios químicos y biológicos de la C. laurifolia sostuvieron un screening preliminar de esa especie. Por lo tanto, el principal objetivo de este trabajo fue el de verificar el potencial anti-Leishmania e inmunomodulador de los extractos obtenidos de C. laurifolia de acuerdo con el conocimiento tradicional de comunidades quilombolas y realizar un estudio químico preliminar de los extractos que presentaron actividades biológicas.

MATERIALES Y MÉTODOS

COLECTA DEL MATERIAL BOTÁNICO

Fueron colectadas hojas, cáscaras del tallo y semillas de C. laurifolia en el período de setiembre de 2002, en la comunidad de Arancuá (596083,59 E; 9833128,18 N -UTM), uno de los 27 remanentes de quilombos, situada al margen del río Trombetas, en el Municipio de Oriximiná en el Oeste del Estado de Pará, Brasil. La especie vegetal se seleccionó a partir de un levantamiento etnobotánico realizado en mayo de 2002³, que tuvo como principal objeto identificar las especies vegetales más utilizadas por la comunidad para el tratamiento de LC. La identificación de la especie fue realizada por la botánica Elisabeth van den Berg, herbario del Museo Paraense Emílio Goeldi, Belém, Pará.

CONSIDERACIONES ÉTICAS

Las actividades de colecta fueron iniciadas después de obtener el consentimiento previo de la comunidad, que se dio por la firma de un término de consentimiento libre y esclarecido (TCLE), por los principales representantes de la comunidad.

PRODUCCIÓN DE LOS EXTRACTOS

Luego de la pulverización del material colectado (molino eléctrico de cuchillas - Willey), a partir de las hojas (1.000 g), se prepararon extractos acuosos utilizando agua a temperatura ambiente (AFF - extracto acuoso a frío de la hojas) y agua a 50^o C (AQF - extracto acuoso en caliente de la hoja) por maceración de ocho días, siendo que la concentración del filtrado fue hecha en liofilizador. La cáscara del tallo, 550 g, fue pulverizada en molino y luego de la maceración en solvente hidroalcohólico (etanol/agua - 1:1), por un período de 15 días, el filtrado fue concentrado en rotaevaporador a 50^o C (HC-extracto hidroalcolohólico de la cáscara). En el preparo del extracto acuoso de la semilla, luego de triturada (rallador doméstico) el material fue macerado en agua a temperatura ambiente e inmediatamente filtrado y el extracto seco obtenido en liofilizador (ASL - extracto acuoso de la semilla producido en laboratorio). En ese sentido, se probó también un extracto acuoso de la semilla producido por un curandero de la comunidad, que se denominó ASC (extracto acuoso de la semilla producido por la comunidad), en la preparación de ese extracto, la comunidad expone el macerado acuoso, luego de triturar la semilla en un rallador, a la luz solar, hasta la evaporación total del solvente, lo que resulta en un polvo seco, con textura y coloración distintas al extracto obtenido en laboratorio. Todos los extractos obtenidos se diluyeron en 1% de DMSO (Sigma, EUA) para el preparo de una solución stock (10 mg/mL) que fue conservada a -20^o C hasta el momento del uso.

ANIMALES

Se utilizaron ratones BALB/c, hembras, con edad entre 2 y 3 meses (n = 1/ensayo), todos oriundos del bioterio del Instituto Evandro Chagas, Belém, Pará. Los animales sufrieron eutanasia en cámara de CO₂ y éter.

CULTIVO DE LOS PARÁSITOS

Promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) se cultivaron a 27^o C en medio completo, i.e. RPMI 1640 (Sigma, EUA), conteniendo 10% de suero bovino fetal inactivado (SBF) (Gibco, EUA); L-glutamina, 2 mM (Sigma, EUA); piruvato de sodio, 1,25 mM (Merk, Alemania); penicilina, 100 UI/mL; estreptomicina, 100 μg/mL (Sigma, EUA) y mercaptoetanol, 50 μM (Gibco, EUA).

OBTENCIÓN DE CÉLULAS ESPLÉNICAS Y DE MACRÓFAGOS PERITONEALES

Los ratones sufrieron eutanasia con CO₂ o éter, y en ambiente aséptico, se les retiró el bazo o células residentes de la cavidad peritoneal. Para la obtención de esplenocitos, el bazo fue macerado en medio RPMI-1640, y en seguida, el sobrenadante de esta suspensión, se lavó dos veces en medio RPMI-1640 (10'/1500 rpm/10^o C). Los macrófagos residentes fueron colectados en la cavidad peritoneal en medio Hank's (Sigma, EUA) y lavados en medio RPMI-1640 dos veces (10'/1500 rpm/10^o C). El número de células esplénicas y de macrófagos luego del lavado, se determinó con el auxilio de un microscopio óptico y ajustado de acuerdo a las pruebas en medio RPMI-1640 conteniendo 10% de suero bovino fetal, penicilina 100 UI/mL y estreptomicina 100 μg/mL (medio completo).

EVALUACIÓN DE LA CITOXICIDADE DE LOS EXTRACTOS VEGETALES

Células esplénicas (6 x 106 células/pozo) fueron distribuidas en placas de cultivo de 96 cavidades (Costar) e incubadas (37^o C/ 24 h, 5% CO₂ y 95% aire) en presencia de extractos vegetales (1 y 0,1 mg/mL) y ³H-timidina (1 μC/pozo) (Amersham Life Science, Inglaterra). Fueron utilizados controles que consistieron solamente de (i) suspensión de células y medio de cultura (control negativo) y (ii) suspensión de células y saponina (Sigma, EUA) (1 mg/mL) (control positivo). Luego de incubación, las células se colectaron en membranas de fibra de vidrio para conteo de radioactividad incorporada en un contador β (Cintilador, Tri-cab-2100TR, Packard). El porcentaje de células viables fue determinado por el índice de citotoxicidade (IC), dado por la cantidad de ³H-timidina incorporada por las células tratadas con extractos en relación a las células del control negativo del ensayo.

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTI-PROMASTIGOTA

Formas promastigotas de L. (L.) amazonensis, obtenidas durante la fase logarítmica de crecimiento (3-4 días), fueron reunidas por centrifugado y suspensas en medio RPMI completo (5 x 107 parásitos/mL), para posterior distribución en una placa de cultivo de 96 cavidades. En seguida, fueron incubadas (26^o C/24 h) en presencia de los extractos vegetales (0,1 mg/mL). Los controles consistieron de: (i) suspensión de promastigotas y medio de cultivo y (ii) suspensión de promastigotas y Anfotericina B (Sigma, EUA) (25 μL/g/mL). Luego de la incubación, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) (Sigma, EUA) (5 mg/mL) fue adicionado al cultivo, sucediéndose nueva incubación (3 h/26^o C). La viabilidad de las formas promastigotas fue evaluada con base en el metabolismo del MTT, resultando la misma, proporcional al valor de la absorbancia generada en espectrofotómetro, con largo de onda igual a 570 nm. El porcentaje de parásitos viables se determinó por el índice de inhibición del crecimiento de promastigota (IP), dado por la cantidad de absorbancia de los parásitos tratados con extractos, en comparación al control negativo.

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTI-AMASTIGOTA

Células peritoneales (1 x 10⁵ macrófago/pozo) fueron agregadas en tubos Eppendorfs e incubadas en atmósfera húmeda (37^o C/3 h, 5% CO₂ y 95% aire) juntamente con formas promastigotas de L. (L.) amazonensis (5 x 10⁵ parásitos/pozo) en una proporción de 5:1 (macrófago/promastigota). Luego de la infección de los macrófagos, estos fueron incubados (37^o C/24 h, 5% CO₂ y 95% aire) en presencia de los extractos vegetales (1 mg/mL). Luego de la incubación, un volumen de 100/μL fue retirado del cultivo y añadido a láminas para centrifugación en Citospin (Fanem, São Paulo) por 5 min a 500 rpm. Esas láminas fueron, entonces, fijadas con metanol absoluto (Cromato Productos Químicos Ltda.) para coloración con colorante Giemsa y posterior análisis microscópico. El número de amastigotas intracelular se determinó por el conteo de amastigotas en 100 macrófagos infectados por muestra y los resultados se expresaron como porcentaje de inhibición en relación al control negativo, pozo conteniendo apenas células y medio RPMI^7,24.

EVALUACIÓN DE LA INHIBICIÓN DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR

Células esplénicas (4 x 10⁶ células/pozo) fueron distribuidas en placa de 96 cavidades e incubadas (37^o C/36 h, 5% CO₂ y 95% aire) con concanavalina A (1 /μg/mL) y extractos de C. laurifolia (0,1 mg/mL). Luego de la incubación se añadieron 10 jUL de ³H-timidina (1 /UCi), sucedendo nova incubação (37^o C/12 h, 5% CO₂ y 95% aire). Las células fueron entonces colectadas en membranas de fibra de vidrio y sometidas a lectura en un contador de radiación¹⁵. El porcentual de inhibición de la linfoproliferación fue dado porun índice de inhibición de la incorporación de ³H-timidina en cultivos de células estimuladas con ConA en presencia de los extractos, con las células cultivadas apenas en presencia de los extractos.

EVALUACIÓN DE LA INHIBICIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ÓXIDO NÍTRICO

Macrófagos peritoneales (1 x 10⁶ células/pozo) fueron distribuidos en placa de cultivo de 96 cavidades para posterior incubación en atmósfera húmeda (37^o C/2 h, 5% CO₂ y 95% aire). Después de la remoción de las células no adheridas, fueron añadidas al cultivo LPS (Sigma, EUA) (Lipopolysaccharides Escherichia coli 0111:B4) (500 ng/mL), IFN-γ (5 ng/mL) y extractos de C. laurifolia (0,1 mg/mL). El control negativo consistió en células adheridas, RPMI completo, LPS (500 ng/mL) y IFN-γ (5 ng/mL), y el positivo apenas de células adheridas y RPMI completo. Se sucedió la incubación (37^o C/24 h, 5% CO₂ y 95% aire). En seguida, los sobrenadantes de los cultivos fueron aspirados y la dosificación de ON producido se realizó de acuerdo al método de Griess⁶. El porcentual de inhibición fue dado por un índice de inhibición de la producción de óxido nítrico de las células tratadas con extracto, en comparación a la producción de óxido nítrico de las células no tratadas con extracto.

ESPECTRO DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR / SCREENING FITOQUÍMICO

Los espectros de RMN ¹H a 300 MHz fueron registrados en espectrómetro modelo Mercury 300/Varian (DQ-UFPA), y a 500 MHz en espectrómetro modelo DRX500/Bruker (CENAUREN-DQ-UFC). Para la realización del análisis fotoquímico se preparó una solución estándar con el extracto liofilizado de las semillas. Cerca de 5 g del extracto fueron transferidos para un vaso de precipitado (Becker) y disueltos en 30 mL de alcohol a 80%. La solución obtenida se llevó a baño maría por 30 min. y se filtró bajo presión. Con la solución resultante se hicieron análisis químicos para verificar la presencia de las siguientes clases de metabolitos secundarios: alcaloides, flavonoides, taninos, saponinas, esteroides, triterpenoides, antraquinona.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los datos obtenidos en este trabajo fueron analizados con el auxilio del programa GraphPad InStat (ANOVA).

RESULTADOS

En los ensayos biológicos, ninguno de los extractos de C. laurifolia fue citotóxico en la concentración 0,1 mg/mL, variando entre 0,6% (HC) a 14,4% (AQF), e inferiores al índice considerado positivo para citotoxicidad (30%), bien como al control saponina (p<0,01) (datos no presentados). A pesar de esta concentración haber sido estandarizada para casi todos los ensayos, la concentración de 1 mg/mL fue evaluada posteriormente, y utilizada para investigar actividad anti-amastigota intracelular. Sin embargo, aún en esta concentración diez veces superior en relación a la primera los índices de citotoxicidad variaron entre 0% (AQF, AFF) y 3,8% (HC), lo que sugiere la ausencia de actividad tóxica sobre macrófagos, aun cuando usadas altas concentraciones de los extractos. Todos los extractos revelaron también, bajos índices de citotóxicos, tanto para las formas promastigotas (<3.3%) (Figura 1) como para las amastigotas intracelulares de L. (L.) amazonensis (<20%) (Figura 2). Bajos índices también fueron observados para la inhibición de la producción de ON en macrófagos activados, pues los porcentuales variaron de 14% (extracto acuoso de la semilla producido en laboratorio) a 23% (extracto hidroalcohólico de la cáscara), difiriendo significativamente del control negativo, células que no recibieron tratamiento (Figura 3). Sin embargo, esos extractos inhibieron significativamente la proliferación de células esplénicas aisladas de ratones BALB/c cultivadas con concanavalina A. Este efecto inhibitorio de la linfoproliferación se hizo mas evidente en el extracto ASC, llegando a 86% (Figura 4A), y observado en menor escala en los demás extractos (33,8 a 38,5%) cuando evaluados en la concentración de 0,1 mg/mL. Ya el extracto ASL presentó índices de inhibición semejantes al ASC apenas cuando probado en una concentración diez veces mayor (1 mg/mL) (Figura 4B).

Figura 1 – Efecto leishmanicida de los extractos de Campsiandra laurifolia Benth. Promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis cultivados en presencia de los extractos de la planta (0,1 mg/mL): acuoso a frío de la hoja (AFF), acuoso en caliente de la hoja (AQF), hidroalcohólico de la cáscara (HC), acuoso de la semilla producido por la comunidad (ASC) y acuoso de la semilla producido en el laboratorio (ASL). Como controles negativo y positivo, respectivamente, medio de cultivo (CN) y anfotericina B a 0,025 mg/mL (CP). El índice de inhibición de promastigotas expresa, en porcentaje, la razón entre promastigotas viables^* tratadas y no tratadas con extracto test. Diferencia entre el control positivo y los demás tratamientos (p<0,001)

Figura 2 – Efecto leishmanicida de los extractos de Campsiandra laurifolia Benth. sobre formas amastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis. Macrófagos peritoneales (MØ) de ratones BALB/c infectados con promastigotas de L. (L.) amazonensis y cultivados en la presencia de los extractos de la planta (1 mg/mL): acuoso a frío de la hoja (AFF), acuoso en caliente de la hoja (AQF), hidroalcohólico de la cáscara (HC), acuoso de la semilla producido por la comunidad (ASC) y acuoso de la semilla producido en el laboratorio (ASL). Como controles negativo y positivo, respectivamente, medio de cultivo (CN) y anfotericina B a 0,025 mg/mL (CP). El índice de inhibición de amastigotas expresa, en porcentaje, la razón entre el número de amastigotas^† infectando macrófagos tratados y no tratados con extracto test. Hubo diferencia entre el control positivo y los demás tratamientos (p<0,05)

Figura 3 – Efecto de los extractos de Campsiandra laurifolia Benth. sobre la producción de óxido nítrico en macrófagos activados. Macrófagos peritoneales (MØ) de ratones BALB/c cultivados en presencia de LPS (500 ng/mL) y IFN-γ (5 ng/mL) y de los extractos de la planta: A – acuoso a frío de la hoja (AFF), acuoso en caliente de la hoja (AQF), hidroalcohólico de la cáscara (HC) y acuoso de la semilla producido por la comunidad (ASC) en la concentración de 0,1 mg/mL y B – acuoso de la semilla producido en laboratorio (ASL) en las concentraciones de 0,01; 0,1; 1 mg/mL. Como controles negativo y positivo, respectivamente, medio de cultivo con LPS e IFN-γ (CN) y medio de cultivo (CP). El índice de inhibición de la producción de óxido nítrico expresa, en porcentaje, la razón entre niveles de ON^‡ producido por las células tratadas y no tratadas con el extracto test. Diferencia entre el control positivo y los demás tratamientos (p<0,001)

Figura 4 – Efecto de los extractos de Campsiandra laurifolia Benth. sobre la linfoproliferación celular. Esplenocitos de ratones BALB/c cultivados en presencia de mitógeno (ConA; 0,001 mg/mL) y del A extracto: – acuoso a frío de la hoja (AFF), acuoso en caliente de la hoja (AQF), hidroalcohólico de la cáscara (HC) y acuoso de la semilla producido por la comunidad (ASC) en la concentración de 0,1 mg/mL; B – extracto acuoso de la semilla producido en laboratorio (ASL) en las concentraciones de 0,1; 0,01 e 0,001 mg/mL. Como controles negativo y positivo, respectivamente, medio de cultivo con mitógeno (CN) y medio de cultivo (CP). El índice de inhibición de la linfoproliferación expresa, en porcentaje, la razón entre células viables^§ tratadas y no tratadas con dilución test del extracto. Diferencia entre el control positivo y los demás tratamientos (p<0,001)

En el sentido de verificar si había diferencias químicas entre los extractos ASC y ASL, que justificaran actividades biológicas diferenciadas, fueron observados cromatogramas y espectro de RMN ¹H. En este análisis químico preliminar se constató que tanto las diferencias físicas entre el extracto ASC (marrón y granulado) y el ASL (blanco y con aspecto de un polvo fino), como sus actividades biológicas, pueden haber resultado del desaparecimiento de sustancias polares, de acuerdo al cromatograma y espectro de RMN ¹H del extracto ASC (datos no presentados), ocurrido durante la eliminación del solvente.

DISCUSIÓN

En un levantamiento etnobotánico, realizado en la comunidad de Arancua, Belém y Menezes³ identificaron 12 especies vegetales utilizadas por la comunidad para el tratamiento de LC, siendo que C. laurifolia fue la que recibió mayor número de indicaciones. Asociando esa indicación popular y la carencia de estudios químicos y biológicos, C. laurifolia fue seleccionada en este trabajo para evaluación de la actividad anti-Leishmania e inmunomodulación y análisis químico preliminar de los extractos bioactivos. Extractos de diversas partes de la planta se obtuvieron en el laboratorio, y fue también utilizado un extracto acuoso de la semilla producido por un curandero de la comunidad (ASC).

Con relación a la actividad anti-Leishmania, todos los extractos probados presentaron bajos índices de citotoxicidad, tanto para las formas promastigotas como para las amastigotas de L. (L.) amazonensis. Bajos índices de inhibición de ON también se observaron en todos los extractos, sin embargo, el extracto de las semillas se reveló un potente inmunosupresor, siendo el ASC el de mayor potencial (0,1 mg/mL) (Figura 4A e 4B).

Para evaluar las diferencias biológicas entre los dos modos de preparación (ASL y ASC), el polvo (usado de forma tópica), resultante de la extracción acuosa de las semillas - remedio más utilizado por los quilombolas para el tratamiento de las lesiones de LC-fue sometido a un estudio fitoquímico preliminar. Sin embargo, llamó la atención el hecho de que ambos extractos presentaran evidencias físicas bien evidentes, o sea, colores y granulado distintos, sugiriendo una probable distinción química entre ellos. Se especuló que tales transformaciones serían consecuencia, principalmente, de reacciones fotoquímicas sucedidas al extracto ASC (exposición al sol) durante la eliminación del solvente, pues observando el espectro de RMN ¹H algunas sustancias polares presentes en este extracto no se evidenciaron en el ASL (datos no presentados). La producción en menor cantidad de tales sustancias polares puede haber reducido significativamente el potencial inmunosupresor del ASL en comparación al ASC (0,1 mg/mL).

En general, la mensuración de la inmunosupresión se basa en la detección del crecimiento celular resultante de una activación o de condiciones de cultivo, siendo que la inhibición puede suceder cuando las células tienen sus factores de crecimiento suprimidos, o cuando hay inducción de energía o apoptosis celulares¹⁵. Como los extractos de C. laurifolia presentan baja citotoxicidad es probable que su acción sea sobre los mediadores de este crecimiento, y no por inducción de muerte celular, como fue el caso de fracciones alcaloides de Boerhavia diffusa L., Nitaginaceae¹⁷. Además, el porcentual de inhibición de la linfoproliferación del extracto acuoso de la semilla (86%) no fue estadísticamente diferente del valor encontrado en las células cultivadas en ausencia de estímulo mitogénico (98%), o control positivo.

Esta actividad de inhibición de la linfoproliferación se observó también en extracto acuoso de Osbeckia aspera L. (Melastomaceae), planta usada tradicionalmente por indígenas para el tratamiento de enfermedades del hígado. Confiere protección contra hepatotoxicidad, pues, probablemente, la inhibición del número de células lleve a una disminución de los niveles de inflamación¹⁸. Esta correlación se hizo también por Punzon¹⁹ que utilizó extractos hidrometanólicos de Phlebodium decumanum Willd. (Polypodiaceae), demostrando que la inhibición del crecimiento fue acompañada de la disminución de los niveles de IL-1 y TNF. La reducción de la actividad biológica de esas citocinas puede llevar a la disminución de los factores que controlan genes proinflamatorios y de óxido nítrico sintetasa inducible (iONS), siendo considerados interesantes como agentes antiinflamatorios, principalmente para el tratamiento de artritis reumatoide. Otras especies, como Embrica officinalis (Euphorbiaceae) y Evolvulus alsinoides L. (Leguminoseae), presentan actividades inmunosupresoras asociadas a la disminución de las agresiones foliculares de linfocitos en inflamaciones inducidas por adyuvantes de artritis reumatoide en modelos murinos¹¹.

No obstante, independientemente del modo de acción de las drogas, la inhibición de la proliferación celular parece estar asociada a una actividad antiinflamatoria, ya que la reducción del crecimiento celular implica en disminución de receptores solubles producidos por estas células y de proteasas que convierten precursores inactivos en activos¹⁹.

Por el hecho de que las lesiones cutáneas causadas por Leishmania spp., en las fases iniciales de la infección, involucran reacciones inflamatorias, con participación de linfocitos, plasma celular, macrófagos y, en muchos casos, reacciones granulomatosas^16,13, drogas con potencial antiinflamatorio pueden ayudaren la cicatrización de las lesiones. Esto corrobora con la indicación quilombola de C. laurifolia para el tratamiento de LCA, pues su uso puede no estar asociado mayoritariamente con una acción directa sobre el parásito, pero sí con una actividad antiinflamatoria importante, que disminuye los daños tisulares causados por el sistema inmune como respuesta a la infección.

Esta acción antiinflamatoria in vivo, tal vez sea intensificada por el hecho de que los extractos de C. laurifolia presentan un pequeño potencial de inhibición de la producción de ON en macrófagos activados (Figura 3), pues altos niveles de este metabolito, que debería ser tóxico apenas para microorganismos, parásitos o células tumorales, pueden también lesionar células saludables vecinas, siendo este mecanismo responsable por la mayoría de los procesos inflamatorios y autoinmunes^11,8,14,25. Vale la pena resaltar la importancia de la observación del modo de preparo del extracto vegetal, pues la actividad descrita por un grupo étnico puede estar asociada al modo particular de su obtención, como es el caso del extracto ASC que presenta su actividad potenciada atribuida, probablemente a la manera por la cual la comunidad realiza la eliminación del solvente (exposición al sol¹²) y el tipo de solvente (agua del río - rica en materia orgánica y ácidos húmicos²⁴). Otros ensayos se requieren, principalmente utilizando fracciones aisladas del extracto ASC y ASL, en el sentido de elucidar una o más sustancias supuestamente involucradas en la actividad inmunosupresora deese vegetal.

CONCLUSIÓN

No se evidenció actividad anti-Leishmania en ninguno de los extractos de C. laurifolia. Pero, los extractos de la semilla, en mayor evidencia en el extracto producido por la comunidad (ASC), presentan un satisfactorio potencial inmunosupresor. Sin embargo, fracciones purificadas de esos extractos deben ser evaluadas, principalmente polares, con el objetivo de verificar el potencial inmunomodulador y antiinflamatorio deesa especie.

AGRADECIMIENTOS

A la doctora Elisabeth van den Berg, botánica del Museo Paraense Emílio Goeldi, Belém, Pará, por la identificación taxonómica de la especie vegetal en estudio. A los másteres José Fernando Oliveira y Matheus do Santos de Sá del Laboratorio de Inmunofarmacología del Centro de Investigación Gonçalo Muniz/FIOCRUZ, Salvador, Bahia, por la colaboración en la realización de los ensayos biológicos. Al Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq) por el auxilio financiero y a la Intendencia Municipal de Oriximiná por el apoyo logístico en los viajes de campo.

REFERENCIAS

1 Acevedo R, Castro E. Negros do Trombetas: guardiães de matas e dos rios. 2. ed. Belém: CEJUP; 1998. 98 p.

2 Akendengue B, Ngou-Milana E, Laurens A, Hocquemiller R. Recent advances in the against Leishmaniasis with natural products. Parasite. 1999 Mar;6(1):3-8.         [ Links ]

3 Belém HRF, Menezes CCS. As terapias tradicionais dos quilombolas de Arancuã [monografia]. Belém: Centro Universitário do Pará, Departamento de Farmácia; 2003.

4 Chan-Bacab MJ, Peña-Rodríguez LM. Plant natural products with leishmanicidal activity. Nat Prod Rep. 2001 Dec;18(6):674-88.

5 Choi CY, Kim JY, Kim YS, Chung YC, Seo JK, Jeong HG. Aqueous extract isolated from Platycodon grandiflorum elicits the release of nitric oxide and tumor necrosis factor-a from murine macrophages. Int Immunopharmacol. 2001 Jun;1(6):1141-51. DOI:10.1016/S1567-5769(01)00047-9         [ Links ]

6 Damre AS, Gokhale AB, Phadke AS, Kulkarni KR, Saraf MN. Studies on the immunomodulatory activity o flavonoidal fraction of Tephrosia purpurea. Fitoterapia. 2003 Apr;74(3):257-61. DOI:10.1016/S0367-326X(03)00042-X         [ Links ]

7 Delorenzi CJ, Attias M, Gattass CR, Andrade M, Rezende  C,  Pinto  AC,  et al.  Antilieshmania activity of Indole alkaloide from Peschiera australis. Antimicrob Agents Chemother. 2001 May;45(5):1349-54. DOI:10.1128/AAC.45.5.1349-1354.2001         [ Links ]

8 Flora Filho R, Zilberstein B. Óxido nítrico: o simples mensageiro percorrendo a complexidade: metabolismo, síntese e função. Rev Assoc Med Bras. 2000;46(3):265-71. DOI:10.1590/S0104-42302000000300012         [ Links ]

9 Fournet A, Barrios AA, Munoz V, Hocquemiller R, Cave A. 2-Substituted quiloline alkaloids as potential antiLeishmanial drugs. Antimicrob Agents Chemother. 1993 Apr;37(4):859-63.         [ Links ]

10 Fournet A, Ferreira ME, Arias AR, Ortiz ST, Fuents S, Nakayama H, et al. In vivo efficacy of oral end intralesional administration of 2-substituted quinolines in experimental treatment of new world cutaneous Leishmaniasis caused by Leishmania amazonensis. Antimicrob Agents Chemother. 1996 Nov;40(11):2447-51.         [ Links ]

11 Ganju L, Karan D, Chanda S, Srivastava KK, Sawhney RC, Selvamurthy W. Immunomodulatory effects of agents of plant origin. Biomed Pharmacother. 2003 Sep;57(7):296-300. DOI:10.1016/S0753-3322(03)00095-7         [ Links ]

12 Goradio AC. Modelos clássicos de estudo quantitativo das relações entre estrutura química e atividade biológica. Quim Nova. 1996;9(3):278-89.         [ Links ]

13 Hepburn NC. Cutaneous Leishmaniasis. Clin Exp Dermatol. 2000 Jul;25(5):363-70. DOI:10.1046/j.1365-2230.2000.00664.x         [ Links ]

14 Ignácio SRN, Ferreira JLP, Almeida MB, Kubelka CF. Nitric oxide production by murine peritoneal macrophages in vitro and in vivo treated with Phyllanthus tenellus extracts. J Ethnopharmacol. 2001 Feb;74(2):181-7. DOI:10.1016/S0378-8741(00)00371-8         [ Links ]

15 Kaufmann SHE, Kabelitz D. Immunology of infection: methods in microbiology. New York:  Academic Press; 1998.

16 Machado P, Araújo C, Silva AT, Almeida RP, D'Oliveira A Jr, Bittencourt A, et al. Failure of early treatment of cutaneous Leishmaniasis in preventing the development of ulcer. Clin Infect Dis. 2002 Jun;34(12):69-73. DOI:10.1086/340526         [ Links ]

17 Mungantiwar AA, Nair AM, Shinde UA, Dikshit VJ, Saraf MN, Thakur VS, et al. Studies on the immunomodulatory effects of Boerhaavia diffusa alkaloidal fraction. J Ethnopharmacol. 1999 May;65(2):125-31. DOI:10.1016/S0378-8741(98)00153-6         [ Links ]

18 Nichol DS, Daniels HM, Thabrew MI, Grayer RJ, Simmonos MSJ, Hughes RD. In vitro studies on the immunomodulatory effects of extracts of Osbeckis aspera. J Ethnopharmacol. 2001 Nov;78(1):39-44.         [ Links ]

19 Punzon C, Alcaide A, Fresno M. In vitro anti-inflammatory activity of Phlebodium decumanum. Modulation of tumor necrosis factor and soluble TNF receptores. Int Immunopharmacol. 2003 Set;3(9):1293-9. DOI:10.1016/S1567-5769(03)00117-6         [ Links ]

20 Roberts LJ, Handman E, Foote SJ. Science, medicine, and the future: Leishmaniasis. BMJ. 2000 Sep;321(7264):801-4.         [ Links ]

21 Sampaio RNR, Takano GHS, Malacarne ACB, Pereira TR, Magalhães AV. Ineficácia in vivo da terbinafina em leishmaniose cutânea causada por Leishmania (Leishmania) amazonensis em camundongos C57BL6. Rev Soc Bras Med Trop. 2003 jul-ago;36(4):531-3. DOI:10.1590/S0037-86822003000400018         [ Links ]

22 Torres-Santos EC, Moreira DL, Kaplan MAC, Meireiles MN, Rossi-Bergmann B. Selective effect of 2'6'-dihydroxy-4'-methoxychalcone isolated from Piper aduncum on Leishmania amazonensis. Antimicrob Agents Chemother. 1999 May;43(5):1234-41.         [ Links ]

23 Tropical Plant Database. Campsiandra laurifolia [Internet]. Carson: Raintree Nutrition. 1996. [citado 2009 set 16]. Disponível em: http://www.rain-tree.com/Campsiandra.htm.         [ Links ]

24 Van Rensburg CE, Naude PJ. Potassium humate inhibits complement activation and the production of inflammatory cytokines in vitro. Inflammation. 2009 Aug;32(4):270-6. DOI:10.1007/s10753-009-9130-6         [ Links ]25 Zhao F, Nozawa H, Daikonnya A, Kondo K, Kitanaka S. Inhibitors of Nitric Production from Hops (Humulus lupulus L.). Biol Pharm Bull. 2003 Jan;26:61-5.         [ Links ]

Correspondência/Correspondence/Correspondencia:
Anadeiva Portela Chagas
Instituto Evandro Chagas
Seção de Parasitologia, Laboratório de Imunologia e Epidemiologia
Rodovia BR316, km 7, s/n^o, Levilândia
CEP: 67030-000 Ananindeua-Pará-Brasil
E-mail: anadeivachagas@iec.pa.gov.br

Recebido em / Received / Recibido en: 31/7/2009
Aceito em / Accepted / Aceito en: 25/9/2009

^* Metabolización del MTT.

^† Análisis microscópico de muestra teñida con Giemsa.

^‡ Método de Griess.

^§ Incorporação de ³H-timidina.