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Revista Pan-Amazônica de Saúde

versão impressa ISSN 2176-6223versão On-line ISSN 2176-6223

Rev Pan-Amaz Saude v.1 n.1 Ananindeua mar. 2010

http://dx.doi.org/10.5123/S2176-62232010000100017 

ARTIGO ORIGINAL | ORIGINAL ARTICLE | ARTÍCULO ORIGINAL

 

Potencial anti-Leishmania e imunomodulador dos extratos de Campsiandra laurifolia Benth. (Fabaceae)

 

Anti-Leishmania and immunomodulatory potential of extracts of Campsiandra laurifolia Benth. (Fabaceae)

 

Potencial anti-Leishmania y inmunomodulador de extracto de Campsiandra laurifolia Benth. (Fabaceae)

 

 

Anadeiva Portela ChagasI; Adolfo Henrique MüllerII; Milene SoaresIII; Lourdes Maria GarcezIV

IInstituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil
IIUniversidade Federal do Pará, Belém, Pará, Brasil. Centro Universitário do Pará, Belém, Pará, Brasil
IIICentro de Pesquisa Gonçalo Muniz/FIOCRUZ, Salvador, Bahia, Brasil
IVInstituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil. Universidade do Estado do Pará, Belém, Pará, Brasil

Endereço para correspondência
Correspondence
Dirección para correspondencia

 

 


RESUMO

Infusões das folhas, cascas e sementes de Campsiandra laurifolia Benth. (Fabaceae) são utilizadas por comunidade de negros descendentes de escravos (quilombolas) para o tratamento, principalmente, de leishmaniose cutânea (LC), feridas, úlceras e impigens. Extratos hidroalcóolicos e aquosos de C. laurifolia foram investigados para a atividade anti-Leishmania sobre promastigotas e amastigota de Leishmania (L.) amazonensis e resposta imunomoduladora: proliferação celular de esplenócitos e produção ON por macrófagos peritoniais de camundongos BALB/c. Os extratos hidroalcóolicos da casca e aquosos da folha e semente apresentaram reduzida atividade contra as formas amastigotas e promastigotas (<20%) e o mesmo foi observado para a inibição da produção de ON por macrófagos ativados (<23%). A maioria dos extratos revelou moderado potencial imunossupressor (32,6% a 38,5%), mas os extratos aquosos da semente (AS) inibiram em até 87% o crescimento de esplenócitos de BALB/c estimulados com mitógenos. Tal atividade talvez explique a indicação quilombola de C. laurifolia para o tratamento de LC, pois o seu uso pode não estar associado majoritariamente com uma ação direta sobre o parasito, mas sim com uma atividade anti-inflamatória, de vez que, tal atividade diminui os danos teciduais causados pelo sistema imune em resposta à infecção e, consequentemente, ajuda na cicatrização das lesões leishmanióticas.

Palavras-chave: Fitoterapia; Extratos Vegetais; Fabaceae; Leishmaniose; Imunossupressão.


ABSTRACT

Infusions of leaves, bark and seeds of Campsiandra laurifolia Benth. (Fabaceae) are used by communities of African-American descendants of slaves (quilombolas) mainly for treatment of cutaneous Leishmaniasis (CL), wounds, ulcers and tinea. Hydroalcoholic and aqueous extracts of C. laurifolia were investigated for anti-Leishmania activity on promastigotes and amastigotes of Leishmania (L.) amazonensis and immunomodulatory responses, including cell proliferation of splenocytes and NO production by peritoneal macrophages from BALB/c mice. The hydroalcoholic extracts of the bark and the aqueous extracts of the leaves and seeds presented a reduced activity against amastigotes and promastigotes (<20%), and the same result was observed for the inhibition of NO production by activated macrophages (<23%). Most of the extracts displayed a moderate immunosuppressive potential (32.6 to 38.5%); on the other hand, the aqueous extracts of seeds inhibited up to 87% of the growth of splenocytes of BALB/c mice stimulated with mitogens. Such activity may explain the use of C. laurifolia for the treatment of CL by quilombolas. Its use may not be mainly associated with a direct action on the parasite but with an anti-inflammatory activity because such activity decreases the tissue damage caused by the immune system in response to the infection and, consequently, aids the healing process of Leishmanial lesions.

Keywords: Phytotherapy; Plant Extracts; Fabaceae; Leishmaniasis; Immunosuppression.


RESUMEN

Las infusiones de las hojas, cortezas y semillas de Campsiandra laurifolia Benth. (Fabaceae) son utilizadas por las comunidades de descendientes de esclavos negros (denominados quilombos) para el tratamiento, principalmente, de la Leishmaniasis cutánea (LC), de heridas en la piel, de úlceras e impétigo. Se investigó con extractos hidroalcohólicos y acuosos de C. laurifolia la actividad anti-Leishmania en promastigotes de Leishmania (L.) amazonensis y la respuesta inmunomoduladora: proliferación celular de esplenocitos y producción de ON por macrófagos peritoneales de ratones BALB/c. Los extractos hidroalcohólicos de la corteza y acuosos de la hoja y de la semilla presentaron una menor actividad frente a las formas de amastigotes y promastigotes (<20%) y el mismo se observó para la inhibición de la producción de ON por los macrófagos activados (<23%). La mayoría de los extractos presentaron un moderado potencial inmunosupresor (de 32,6% a 38,5%), pero los extractos acuosos de la semilla (AS) inhiben hasta un 87% el crecimiento de esplenocitos BALB/c estimulados con mitógenos. Esa actividad puede explicar la indicación de los descendientes de quilombos (quilombolas) del uso de C. laurifolia para el tratamiento de LC, ya que su uso puede no estar asociado principalmente con una acción directa sobre el parásito, sino con una actividad inflamatoria, pues esa actividad disminuye el daño tisular causado por el sistema inmunológico en respuesta a la infección y, en consecuencia, ayuda en la cicratización de las lesiones ocasionadas por la Leishmaniasis.

Palabras clave: Fitoterapia; Extractos Vegetales; Fabaceae; Leishmaniasis; Inmunosupresión.

 

 

INTRODUÇÃO

As leishmanioses constituem um complexo de enfermidades que atingem o homem, iniciadas pela inoculação das espécies do gênero Leishmania durante o repasto sanguíneo de insetos vetores20,7,9. Entre elas, a leishmaniose cutânea (LC) é particularmente importante na América do Sul por apresentar aspecto de cronicidade, latência e por desenvolver metástases que conduzem a quadros clínicos desfigurantes. No tratamento dessa doença, a quimioterapia com antimoniais pentavalentes é extensamente utilizada, porém efeitos adversos, administração parenteral, regimes de tratamento prolongados e aparecimento de resistência justificam a busca de drogas alternativas mais eficazes10,21.

Várias classes de substâncias já foram isoladas, tais como alcalóides, lignanas, neolignanas, terpenos e ácido benzóico, e têm-se mostrado bioativas6. Porém, dentre 97 substâncias levantadas no trabalho de Chan-Bacab e Peña-Rodriguez4, apenas 2-n-propylquinoline, alcalóide das folhas de Galipea longiflora (Rutaceae), está em fase clínica para o tratamento da LC9,10, pois a maioria das substâncias ensaiadas, in vivo, apresenta altos níveis de citotoxicidade e baixa atividade quando administradas em doses  moderadas4,2. Contudo, tais esforços devem ser contínuos, pois a grande variabilidade de linhagens de Leishmania e o aparecimento de formas resistentes conduzem à necessidade de desenvolvimento de diferentes tipos de drogas10.

A espécie Campsiandra laurifolia Benth., uma leguminosa da família Fabaceae, é encontrada, no Brasil, principalmente nos Estados do Pará, Amapá e Amazonas, em áreas de igapó e às margens de igarapés e rios. A Manaiara, como é conhecida popularmente, é utilizada principalmente para o tratamento de feridas, impigem, malária, úlcera23. A comunidade de Arancuã, um dos 27 remanescentes quilombos (descendentes de negros que resistiram à escravidão) dessa região, que fica às margens do rio Trombetas, próximo ao Município de Oriximiná, no Oeste do Estado do Pará, frequentemente se expõem ao vetor da LC, durante três meses do ano (janeiro a março). Nessa época, seus integrantes residem em áreas de floresta, para realizarem a coleta anual da castanha-do-Pará1. Essa comunidade utiliza a infusão das folhas e a tapioca do fruto (parte amilácea obtida a partir da maceração aquosa e secagem em exposição à luz solar) para o tratamento da leishmaniose cutânea3. O uso popular, o grande número de indicações e a ausência de estudos químicos e biológicos da C. laurifolia sustentaram um screening preliminar dessa espécie. Portanto, o principal objetivo deste trabalho foi verificar o potencial anti-Leishmania e imunomodulador dos extratos obtidos de C. laurifolia de acordo com o conhecimento tradicional de comunidades quilombolas e realização de um estudo químico preliminar dos extratos que apresentaram atividades biológicas.

 

MATERIAIS E MÉTODOS

COLETA DO MATERIAL BOTÂNICO

Foram coletadas folhas, cascas do caule e sementes de C. laurifolia no período de setembro de 2002, na comunidade de Arancuã (596083,59 E; 9833128,18 N - UTM), um dos 27 remanescentes de quilombos, situada às margens do rio Trombetas, no Município de Oriximiná no Oeste do Estado do Pará, Brasil. A espécie vegetal foi selecionada a partir de um levantamento etnobotânico realizado em maio de 20023, que teve como principal objeto identificar as espécies vegetais mais utilizadas pela comunidade para o tratamento de LC. A identificação da espécie foi realizada pela botânica Elisabeth van den Berg, herbário do Museu Paraense Emílio Goeldi, Belém, Pará.

CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

As atividades de coleta foram iniciadas após a obtenção da anuência prévia da comunidade que se deu pela assinatura de um termo de consentimento livre esclarecido (TCLE) pelos principais representantes da comunidade.

PRODUÇÃO DOS EXTRATOS

Após a pulverização do material coletado (moinho elétrico de facas - Willey), a partir das folhas (1.000 g), foram preparados extratos aquosos utilizando água a temperatura ambiente (AFF - extrato aquoso a frio da folha) e água a 50o C (AQF - extrato aquoso a quente da folha) por maceração de oito dias, sendo que a concentração do filtrado foi feita em liofilizador. A casca do caule, 550 g, foi pulverizada em moinho e após a maceração em solvente hidroalcoólico (etanol/água - 1:1), por um período de 15 dias, o filtrado foi concentrado em rotaevaporador a 50o C (HC - extrato hidroalcoloólico da casca). Na preparação do extrato aquoso da semente, após a trituração (ralador doméstico) o material foi macerado em água a temperatura ambiente e imediatamente filtrado e o extrato seco obtido em liofilizador (ASL - extrato aquoso da semente produzido em laboratório). Nesse estudo, testou-se também um extrato aquoso da semente produzido por um curandeiro da comunidade, que foi denominado de ASC (extrato aquoso da semente produzido pela comunidade), pois, no preparo desse extrato, a comunidade expõe o macerado aquoso, após a trituração da semente em um ralador, à luz solar, até a evaporação total do solvente, o que resulta em um pó seco, com textura e coloração diferente do extrato obtido em laboratório. Todos os extratos obtidos foram diluídos em 1% de DMSO (Sigma, EUA) para a preparação de uma solução estoque (10 mg/mL) que foi conservada a -20o C até o momento de uso.

ANIMAIS

Foram utilizados camundongos BALB/c, fêmeas, com idade entre 2 e 3 meses (n = 1/ensaio), todos oriundos do biotério do Instituto Evandro Chagas, Belém, Pará. Os animais sofreram eutanásia em câmara de CO2 e éter.

CULTIVO DOS PARASITOS

Promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) foram cultivadas a 27o C em meio completo, i.e. RPMI 1640 (Sigma, EUA), contendo 10% de soro bovino fetal inativado (SBF) (Gibco, EUA); L-glutamina, 2 mM (Sigma, EUA); piruvato de sódio, 1,25 mM (Merk, Alemanha); penicilina, 100 UI/mL; estreptomicina, 100 µg/mL (Sigma, EUA) e 2-mercaptoetanol, 50 µM (Gibco, EUA).

OBTENÇÃO DE CÉLULAS ESPLÊNICAS E DE MACRÓFAGOS PERITONIAIS

Camundongos foram eutanizados com CO2 ou éter, e em ambiente asséptico, ocorreu a retirada do baço ou de células residentes da cavidade peritonial. Para obtenção de esplenócitos, o baço foi macerado em meio RPMI-1640, e em seguida, o sobrenadante desta suspensão, foi lavado duas vezes em meio RPMI-1640 (10'/ 1500 rpm/10o C). Os macrófagos residentes foram coletados da cavidade peritonial em meio Hank's (Sigma, EUA) e lavados em meio RPMI-1640 por duas vezes (10'/ 1500 rpm/10o C). O número de células esplênicas e macrófagos após a lavagem, foi determinado com auxílio de um microscópio ótico e ajustadas de acordo com teste em meio RPMI-1640 contendo 10% de soro bovino fetal, penicilina 100 UI/mL e estreptomicina 100 µg/mL (meio completo).

AVALIAÇÃO DA CITOXICIDADE DOS EXTRATOS VEGETAIS

Células esplênicas (6 x 106 células/poço) foram distribuídas em placas de cultura de 96 cavidades (Costar) e incubadas (37o C/ 24 h, 5% CO2 e 95% ar) em presença dos extratos vegetais (1 e 0,1 mg/mL) e 3H-timidina (1 µC/poço) (Amersham Life Science, Inglaterra). Controles consistindo somente de (i) suspensão de células e meio de cultura (controle negativo) e (ii) suspensão de células e saponina (Sigma, EUA) (1 mg/mL) (controle positivo) foram utilizados. Após incubação, as células foram coletadas em membranas de fibra de vidro para contagem de radioatividade incorporada em um contador ß (Cilintilador, Tri-cab-2100TR, Packard). A porcentagem de células viáveis foi determinada pelo índice de citotoxicidade (IC), dado pela quantidade de 3H-timidina incorporada pelas células tratadas com extratos em relação às células do controle negativo do ensaio.

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-PROMASTIGOTA

Formas promastigotas de L. (L.) amazonensis, obtidas durante a fase logarítimica de crescimento (3-4 dias), foram reunidas por centrifugação e suspensas em meio RPMI completo (5 x 107 parasitos/mL), para posterior distribuição em uma placa de cultura de 96 cavidades. Em seguida, foram incubadas (26o C/24 h) na presença dos extratos vegetais (0,1 mg/mL). Controles consistiram de: (i) suspensão de promastigotas e meio de cultura e (ii) suspensão de promastigotas e Anfotericina B (Sigma, EUA) (25 µg/mL). Após incubação, MTT (3-(4,5-dimethyithiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma, EUA) (5 mg/mL) foi adicionado na cultura, sucedendo-se nova incubação (3 h/26o C). A viabilidade das formas promastigotas foi avaliada com base no metabolismo do MTT, sendo a mesma proporcional ao valor da absorbância gerada em espectofotômetro, sob comprimento de onda igual a 570 nm. A porcentagem de parasitos viáveis foi determinada pelo índice de inibição do crescimento de promastigota (IP), dado pela quantidade de absorbância dos parasitos tratados com extratos, em comparação ao controle negativo.

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-AMASTIGOTA

Células peritoniais (1 x 105 macrófago/poço) foram adicionadas em tubos Eppendorfs e incubadas em atmosfera úmida (37o C/3 h, 5% CO2 e 95% ar) juntamente com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis (5 x 105 parasitos/poço) em uma proporção de 5:1 (macrófago/promastigota). Após a infecção dos macrófagos, estes foram incubados (37o C/24 h, 5% CO2 e 95% ar) em presença dos extratos vegetais (1 mg/mL). Após incubação, um volume de 100 µL foi retirado da cultura e adicionado em lâminas para centrifugação em Citospin (Fanem, São Paulo) por 5 min a 500 rpm. Essas lâminas foram, então, fixadas com metanol absoluto (Cromato Produtos Químicos Ltda.) para coloração com corante Giemsa e posterior análise microscópica. O número de amastigota intracelular foi determinado pela contagem de amastigotas em 100 macrófagos infectados por amostra e os resultados foram expressos como porcentagem de inibição em relação ao controle negativo, poço contendo apenas células e meio RPMI7,24.

AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR

Células esplênicas (4 x 106 células/poço) foram distribuídas em placa de 96 cavidades e incubadas (37o C/36 h, 5% CO2 e 95% ar) com concanavalina A (1 µg/mL) e extratos de C. laurifolia (0,1 mg/mL). Após incubação foram adicionados 10 µL de 3H-timidina (1 µCi), sucedendo nova incubação (37o C/12 h, 5% CO2 e 95% ar). As células foram então coletadas em membranas de fibra de vidro e submetidas à leitura em um contador de radiação ß15. O percentual de inibição da linfoproliferação foi dado por um índice da inibição da incorporação de 3H-timidina em culturas de células estimuladas com ConA na presença dos extratos, com as células cultivadas apenas em presença dos extratos.

AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO

Macrófagos peritoniais (1 x 106 células/poço) foram distribuídos em placa de cultura de 96 cavidades para posterior incubação em atmosfera úmida (37o C/2 h, 5% CO2 e 95% ar). Após a remoção das células não aderidas, foram adicionados à cultura LPS (Sigma, EUA) (Lipopolysaccharides Escherichia coli 0111:B4) (500 ng/mL), (5 ng/mL) e extratos de C. laurifolia (0,1 mg/mL). O controle negativo consistiu de células aderidas, RPMI completo, LPS (500 ng/mL) e (5 ng/mL), e o positivo apenas de células aderidas e RPMI completo. Sucedeu-se a incubação (37o C/24 h, 5% CO2 e 95% ar). Em seguida, os sobrenadantes das culturas foram aspirados e a dosagem de ON produzido, foi feita de acordo com o método de Griess5. O percentual de inibição foi dado por um índice de inibição da produção de óxido nítrico das células tratadas com extrato, em comparação à produção de óxido nítrico das células não tratadas com extrato.

ESPECTRO DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR / SCREENING FITOQUÍMICO

Os espectros de RMN 1H a 300 MHz foram registrados em espectrômetro modelo Mercury 300/Varian (DQ-UFPA), e a 500 MHz em espectrômetro modelo DRX500/Bruker (CENAUREN-DQ-UFC). Para a realização da análise fitoquímica foi preparada uma solução padrão com o extrato liofilizado das sementes. Cerca de 5 g do extrato foram transferidos para um Becker e dissolvidos em 30 mL de álcool a 80%. A solução obtida foi levada ao banho-maria por 30 min e filtrada sob pressão. Com a solução resultante foram feitos testes químicos para verificar a presença das seguintes classes de metabólitos secundários: alcalóides, flavonóides, taninos, saponinas, esteróides, triterpenóides, antraquinona.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados obtidos neste trabalho foram analisados com o auxílio do programa GraphPad InStat (ANOVA).

 

RESULTADOS

Nos ensaios biológicos, nenhum dos extratos de C. laurifolia foi citotóxico na concentração 0,1 mg/mL, variando entre 0,6% (HC) a 14,4% (AQF), e inferiores ao índice considerado positivo para citotoxicidade (30%), bem como ao controle saponina (p<0,01) (dados não apresentados). Apesar desta concentração ter sido padronizada para quase todos os ensaios, a concentração 1 mg/mL foi posteriormente avaliada, e utilizada para investigar atividade antiamastigota intracelulares. Porém, mesmo nesta concentração dez vezes maior em relação à primeira os índices de citotoxicidade variaram entre 0% (AQF, AFF) e 3,8% (HC), o que sugere a ausência de atividade tóxica sobre macrófagos, mesmo quando usadas altas concentrações dos extratos. Todos os extratos revelaram, também, baixos índices de citotóxicos, tanto para as formas promastigotas (<3.3%) (Figura 1) quanto para as amastigotas intracelulares de L. (L.) amazonensis (<20%) (Figura 2). Baixos índices também foram observados para a inibição da produção de ON em macrófagos ativados, pois os percentuais variaram de 14% (extrato aquoso da semente produzido no laboratório) a 23% (extrato hidroalcoólico da casca), diferindo significativamente do controle negativo, células que não receberam tratamento (Figura 3). No entanto, esses extratos inibiram significativamente a proliferação de células esplênicas isoladas de camundongos BALB/c cultivadas com concanavalina A. Este efeito inibitório da linfoproliferação foi mais evidente no extrato ASC, chegando a 86% (Figura 4A), e observado em menor escala nos demais extratos (33,8 a 38,5%) quando avaliados na concentração de 0,1 mg/mL. Já o extrato ASL apresentou índices de inibição semelhantes ao ASC apenas quando testado em uma concentração dez vezes maior (1 mg/mL) (Figura 4B).

 

Figura 1 - Efeito leishmanicida dos extratos de Campsiandra laurifolia Benth. Promastigotas de Leishmania (Leishimania) amazonensis cultivados na presença dos extratos da planta (0,1 mg/mL): aquoso a frio da folha (AFF), aquoso a quente da folha (AQF), hidroalcóolico da casca (HC), aquoso da semente produzido pela comunidade (ASC) e aquoso da semente produzido no laboratório (ASL). Como controles negativo e positivo, respectivamente, meio de cultura (CN) e anfotericina B a 0,025 mg/mL (CP). O índice de inibição de promastigotas expressa, em porcentagem, a razão entre promastigotas viáveis* tratadas e não tratadas com extrato teste. Diferença entre o controle positivo e os demais tratamentos (p<0,001)

 

Figura 2 - Efeito leishmanicida dos extratos de Campsiandra laurifolia Benth. sobre formas amastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis. Macrófagos peritoneais (MØ) de camundongos BALB/c infectados com promastigotas de L. (L.) amazonensis  e cultivados na presença dos extratos da planta (1 mg/mL): aquoso a frio da folha (AFF), aquoso a quente da folha (AQF), hidroalcóolico da casca (HC), aquoso da semente produzido pela comunidade (ASC) e aquoso da semente produzido no laboratório (ASL). Como controles negativo e positivo, respectivamente, meio de cultura (CN) e anfotericina B a 0,025 mg/mL (CP). O índice de inibição de amastigotas expressa, em porcentagem, a razão entre o número de amastigotas infectando macrófagos tratados e não tratados com extrato teste. Houve diferença entre o controle positivo e os demais tratamentos (p<0,05)

 

 

Figura 3 - Efeito dos extratos de Campsiandra laurifolia Benth. sobre a produção de óxido nítrico em macrófagos ativados. Macrófagos peritoniais (MØ) de camundongos BALB/c cultivados empresença de LPS (500 ng/mL) e (5 ng/mL) e dos extratos da planta: A - aquoso a frio da folha (AFF), aquoso a quente da folha (AQF), hidroalcóolico da casca (HC) e aquoso da semente produzido pela comunidade (ASC) na concentração de 0,1mg/mL e B - aquoso da semente produzido no laboratório (ASL) nas concentrações de 0,01; 0,1; 1 mg/mL. Como controles negativo e positivo, respectivamente, meio de cultura com LPS e (CN) e meio de cultura (CP). O índice de inibição da produção de óxido nítrico expressa, em porcentagem, a razão entre níveis de ON produzido pelas células tratadas e não tratadas com o extrato teste. Diferença entre o controle positivo e os demais tratamentos (p<0,001)

 

Figura 4 - Efeito dos extratos de Campsiandra laurifolia Benth. sobre a linfoproliferação celular. Esplenócitos de camundongos BALB/c cultivadas em presença de mitógeno (ConA; 0,001 mg/mL) e do extrato: A - aquoso a frio da folha (AFF), aquoso a quente da folha (AQF), hidroalcóolico da casca (HC) e aquoso da semente produzido pela comunidade (ASC) nas concentrações de 0,1mg/mL; B - extrato aquoso da semente produzido no laboratório (ASL) nas concentrações de 0,1; 0,01 e 0,001 mg/mL. Como controles negativo e positivo, respectivamente, meio de cultura com mitógeno (CN) e meio de cultura (CP). O índice de inibição da linfoproliferação expressa, em porcentagem, a razão entre células viáveis§ tratadas e não tratadas com diluição teste do extrato. Diferença entre o controle positivo e os demais tratamentos (p<0,001)

 

No sentido de verificar se havia diferenças químicas entre os extratos ASC e ASL, que justificassem atividades biológicas diferenciadas, cromatogramas e espectro de RMN 1H foram observados. Nesta análise química preliminar foi constatado que tanto as diferenças físicas entre o extrato ASC (marrom e granuloso) e o ASL (branco e com aspecto de um pó fino) quanto as suas atividades biológicas, podem ter decorrido do desaparecimento de substâncias polares, de acordo com o cromatograma e espectro de RMN 1H do extrato ASC (dados não apresentados), ocorrido durante a eliminação do solvente.

 

DISCUSSÃO

Em um levantamento etnobotânico, realizado na comunidade de Arancuã, Belém e Menezes3 identificaram 12 espécies vegetais utilizadas pela comunidade para o tratamento de LC, sendo que C. laurifolia foi a que recebeu maior número de indicações. Associando a essa indicação popular e à carência de estudos químicos e biológicos, C. laurifolia foi selecionada neste trabalho para avaliação da atividade anti-Leishmania e imunomodulação e análise química preliminar dos extratos bioativos. Extratos de diversas partes da planta foram obtidos no laboratório, e utilizou-se, também, um extrato aquoso da semente produzido por um curandeiro da comunidade (ASC).

Com relação à atividade anti-Leishmania, todos os extratos testados apresentaram baixos índices de citoxicidade, tanto para as formas promastigotas quanto para amastigotas de L. (L.) amazonensis. Baixos índices de inibição de ON também foram observados em todos os extratos, porém, o extrato das sementes se revelou potente imunossupressor sendo o ASC em maior potencial (0,1 mg/mL) (Figura 4A  e 4B).

Para avaliar as diferenças biológicas entre os dois modos de preparo (ASL e ASC), o pó (usado de forma tópica), resultante da extração aquosa das sementes - remédio mais utilizado pelos quilombolas para o tratamento das lesões de LC - foi submetido a um estudo fitoquímico preliminar. Porém, chamou atenção o fato desses dois extratos apresentarem diferenças físicas bem evidentes, isto é, cores e granulosidade diferentes, sugerindo uma provável distinção química entre eles. Especulou-se que tais transformações seriam consequência, principalmente, de reações fotoquímicas ocorridas com extrato ASC (exposição ao sol) durante a eliminação do solvente, pois observando o espectro de RMN 1H algumas substâncias polares presentes neste extrato não foram evidenciadas no ASL (dados não apresentados). A produção em menor quantidade de tais substâncias polares pode ter reduzido significativamente o potencial imunossupressor do ASL em comparação ao ASC (0,1 mg/mL).

Em geral, a mensuração da imunossupressão baseia-se na detecção do crescimento celular resultante de uma ativação ou de condições da cultura, sendo que a inibição pode ocorrer quando as células têm seus fatores de crescimento suprimidos, ou quando há indução de energia ou apoptose celulares15. Como os extratos de C. laurifolia apresentam baixa citotoxicidade é provável que sua ação seja sobre os mediadores deste crescimento, e não pela indução de morte celular, como foi o caso de frações alcalóides de Boerhavia diffusa L., Nitaginaceae17. Além disso, o percentual de inibição da linfoproliferação do extrato aquoso da semente (86%) não foi estatisticamente diferente do valor encontrado nas células cultivadas na ausência de estímulo mitogênico (98%), o controle positivo.

Esta atividade de inibição da linfoproliferação foi observada também em extrato aquoso de Osbeckia aspera L. (Melastomaceae), planta usada tradicionalmente por indígenas para o tratamento de doenças do fígado. Ele confere proteção contra hepatotoxicidade, pois provavelmente a inibição do número de células leve a uma diminuição dos níveis de inflamação18. Esta correlação foi feita também por Punzon19 que utilizou extratos hidrometanólicos de Phlebodium decumanum Willd. (Polypodiaceae), demonstrando que a inibição do crescimento celular foi acompanhada pela diminuição dos níveis de IL-1 e TNF.  A redução da atividade biológica dessas citocinas pode levar à diminuição dos fatores que controlam genes proinflamatórios e de óxido nítrico sintetase induzível (iONS), sendo considerados interessantes como agentes anti-inflamatórios, principalmente para o tratamento de artrite reumatóide. Outras espécies, como Embrica officinalis (Euphorbiaceae) e Evolvulus alsinoides L. (Leguminoseae), apresentam atividades imunossupressoras associadas à diminuição das agressões foliculares de linfócitos em inflamações induzidas por adjuvantes de artrite reumatóide em modelos murinos11.

Todavia, independentemente do modo de ação das drogas, a inibição da proliferação celular parece estar associada a uma atividade anti-inflamatória, pois a redução do crescimento celular implica em diminuição de receptores solúveis produzidos por estas células e de proteases que convertem precursores inativos em ativos19.

Pelo fato das lesões cutâneas causadas por Leishmania spp., nas fases iniciais da infecção, envolverem reações inflamatórias, com participação de linfócitos, plasma celular, macrófagos e, em muitos casos, reações granulomatosas16,13, drogas com potencial anti-inflamatório podem ajudar na cicatrização das lesões. Tal fato corrobora com a indicação quilombola de C. laurifolia para o tratamento de LCA, pois o seu uso pode não estar associado majoritariamente com uma ação direta sobre o parasito, mas sim com uma atividade anti-inflamatória importante, que diminui os danos teciduais causados pelo sistema imune em resposta à infecção.

Esta ação anti-inflamatória, in vivo, talvez seja intensificada pelo fato dos extratos de C. laurifolia apresentarem um pequeno potencial de inibição da produção de ON em macrófagos ativados (Figura 3), pois altos níveis desse metabólito, que deveria ser tóxico apenas para microorganismos, parasitos ou células tumorais, podem também lesar células saudáveis vizinhas, sendo este mecanismo responsável pela maioria dos processos inflamatórios e autoimunes11,8,14,25. Vale a pena ressaltar a importância da observação do modo de preparo do extrato vegetal, pois a atividade descrita por um grupo étnico pode estar associada ao modo particular de sua obtenção, como é o caso do extrato ASC que apresenta sua atividade potencializada atribuída, provavelmente, à maneira pela qual a comunidade faz a eliminação do solvente (exposição ao sol12) e o tipo de solvente (água do rio - rica em matéria orgânica e ácidos húmicos24). Outros ensaios são requeridos, principalmente utilizando frações isoladas do extrato ASC e ASL no sentido de elucidar uma ou mais substâncias supostamente envolvidas na atividade imunossupressora desse vegetal.

 

CONCLUSÃO

Atividade anti-Leishmania não foi evidenciada em nenhum dos extratos de C. laurifolia. Porém, os extratos da semente, em maior evidência no extrato produzido pela comunidade (ASC), apresentam satisfatório potencial imunossupressor. No entanto, frações purificadas desses extratos devem ser avaliadas, principalmente polares, com o objetivo de verificar o potencial imunomodulador e anti-inflamatório dessa espécie.

 

AGRADECIMENTOS

A doutora Elisabeth van den Berg, botânica do Museu Paraense Emílio Goeldi, Belém, Pará, pela identificação taxonômica da espécie vegetal em estudo. Aos mestres José Fernando Oliveira e Matheus do Santos de Sá do Laboratório de Imunofarmacologia do Centro de Pesquisa Gonçalo Muniz/FIOCRUZ, Salvador, Bahia, pela colaboração na realização dos ensaios biológicos. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo auxílio financeiro e à Prefeitura Municipal de Oriximiná pelo apoio logístico nas viagens de campo. 

 

REFERÊNCIAS

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Correspondência/Correspondence/Correspondencia:
Anadeiva Portela Chagas
Instituto Evandro Chagas
Seção de Parasitologia, Laboratório de Imunologia e Epidemiologia
Rodovia BR316, km 7, s/no, Levilândia
CEP: 67030-000 Ananindeua-Pará-Brasil
E-mail: anadeivachagas@iec.pa.gov.br

Recebido em / Received / Recibido en: 31/7/2009
Aceito em / Accepted / Aceito en: 25/9/2009

 

 

* Metabolização de MTT.

Análise microscópica de amostra corada pelo Giemsa.

Método de Griess.

§ Incorporação de 3H-timidina.