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Revista Pan-Amazônica de Saúde

versão On-line ISSN 2176-6223

Rev Pan-Amaz Saude v.1 n.1 Ananindeua mar. 2010

http://dx.doi.org/10.5123/S2176-62232010000100018 

ARTIGO ORIGINAL

 

Caracterização molecular de rotavírus humanos do tipo G1 detectados em crianças de Belém, Pará, Brasil

 

 

Luana da Silva SoaresI; Joana D'Arc Pereira MascarenhasI; Yvone Benchimol GabbayI; Rosa Helena Porto GusmãoII; Alexandre da Costa LinharesI

ISeção de Virologia, Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brazil
IICentro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade do Estado do Pará, Belém, Pará, Brazil

Endereço para correspondência
Correspondence
Dirección para correspondencia

 

Título original: Molecular characterization of G1 human rotaviruses detected in children from Belém, Pará, Brazil. Traduzido por: André Diniz.

 

 


RESUMO

Os rotavírus são responsáveis por 40% das ocorrências de gastroenterites infantil no mundo, resultando em 611 mil mortes anualmente, e o rotavírus do tipo G1 representa o seu genótipo circulante mais comum. O objetivo do presente artigo foi realizar a caracterização molecular das amostras de rotavírus do tipo G1 obtidas de crianças que participaram de estudos anteriormente conduzidos na Cidade de Belém, norte do Brasil, por um período de 21 anos (1982 a 2003). O rotavírus do tipo G1 foi detectado por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida, ensaio imunoenzimático (EIA) e reação em cadeia da polimerase precedida da transcrição reversa para os genes VP7 e VP4. Dos 798 espécimes positivos para rotavírus, 330 (41%) apresentavam especificidade G1 por EIA, usando anticorpos monoclonais. Um total de 148 amostras do tipo G1 foram analisadas por meio da reação em cadeia da polimerase precedida da transcrição reversa. A caracterização dos eletroferotipos e genótipos P dos rotavírus do tipo G1 ocorreu em frequências de 78% e 88%, respectivamente. Três variedades de eletroferotipos longos foram identificados, sendo L1 a predominante (79%). A combinação G1P[8] foi a mais frequente, responsável por 64% dos casos. As infecções mistas G1P[6]+P[8], G1P[4]+P[8], G1P[4]+P[6] e G1P[4]+P[6]+P[8] foram encontradas em 11 (7%), 11 (7%), 3 (2%) e 1 (0,6%) amostras, respectivamente. Uma amostra apresentando infecção mista G1+G4 foi identificada. Ressalte-se que este é o primeiro estudo a abordar a caracterização molecular de rotavírus do tipo G1 no Brasil. Nossos achados permitirão melhor compreensão a respeito da diversidade molecular associada às infecções por rotavírus do tipo G1 em nossa região.

Palavras-chave: Gastroenterites; Infecções por Rotavírus; Variação Genética.


 

 

INTRODUÇÃO

O rotavírus do grupo A (RV-A) é o agente etiológico mais comum da gastrenterite severa no mundo, sendo responsável por 40% das infecções por gastrenterite e resultando em 611 mil mortes anuais de recém-nascidos e crianças, especialmente nos países mais pobres. O alcance global desta rotavirose é bem reconhecido; na verdade, todas as crianças apresentam um caso de gastrenterite causada por rotavírus antes dos 5 anos de idade7,24,25.

O rotavírus pretence à família Reoviridae e é classificado em sete grupos (A-G) e quatro subgrupos (I, II, I + II, e não-I/II) de acordo com as especificidades dos epítopos na proteína VP6 que constitui o capsídeo interno. O genoma do rotavírus contém 11 segmentos de RNA de fita dupla (dsRNA) dentro do núcleo de um capsídeo de tripla camada. O capsídeo externo é composto de duas proteínas estruturais, VP4 e VP7, que definem os genotipos P (proteína clivada por protease) e G (glicoproteína), respectivamente. Com base na mobilidade dos 11 segmentos em gel de poliacrilamida, os rotavírus podem ser identificados como eletroferotipos longos, curtos ou "supercurtos"11.

Até o presente momento, pelo menos 23 rotavírus do tipo G e 30 do tipo P foram identificados tomando-se por base a análise sequencial dos genes VP7 e VP4, respectivamente. Entretanto, sabe-se que poucos genotipos causam infecção em humanos5,6,11,31,32. Apesar de um grande número de combinações G/P ser teoricamente possível, estudos epidemiológicos no mundo todo têm registrado a circulação de cinco genótipos mais comuns: G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8] e G9p[8]6,7,11,19,29.

O genótipo mais prevalente é o G1, que tem sido detectado com taxas de frequências que variam entre 36% e 74% em diferentes regiões do mundo, sendo que as cepas G1P[8] representam aproximadamente 65% de todos os rotavírus identificados29. Castello et al6 identificaram cepas de G1P[8] em 40% das infecções por rotavírus na América Latina. Recentemente, Leite et al19 detectaram cepas de G1 em 43% dos casos durante o período pré-vacinação no Brasil; em contraste, após a introdução de programas de vacinação, a ocorrência deste genótipo reduziu para 3% das infecções por rotavírus, devido à grande predominância das cepas de G2P[4].

A análise sequencial do gene VP7 das cepas do rotavírus humano do tipo G1 na Itália revelou a existência de pelo menos três linhagens genéticas. Estas variantes de antígenos podem ser responsáveis pela circulação contínua do rotavírus do tipo G12. Phan et al28 analisaram o gene VP7 de cepas do rotavírus do tipo G1 coletadas no mundo todo e sugeriram uma nova taxonomia, que inclui 11 linhagens e 17 sublinhagens.

O objetivo do presente estudo foi realizar a caracterização molecular das amostras de rotavírus do tipo G1 obtidas de crianças que participaram de vários estudos anteriormente conduzidos em Belém, Região Norte do Brasil, por um período de 21 anos (de 1982 a 2003).

 

MATERIAIS E MÉTODOS

PACIENTES E ESPÉCIMES CLÍNICOS

Os espécimes obtidos de cinco estudos sobre gastrenterite viral realizados em Belém, Brasil, entre dezembro de 1982 e outubro de 2003, foram analisados com vistas à detecção de rotavírus1,15,20,21. Dos 798 espécimes positivos para rotavírus por ensaio imunoenzimático (EIA), 330 (41%) apresentavam especificidade G1 quando utilizados anticorpos monoclonais. Para confirmar esse resultado, foram analisadas 148 cepas de rotavírus do tipo G1 por meio da reação em cadeia de polimerase precedida de transcrição reversa (RT-PCR). Esta análise envolveu todas as cepas de G1 detectadas nos Estudos A, B, C e D, e 20% dos casos do Estudo E. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto Evandro Chagas, Secretaria Nacional de Vigilância em Saúde.

EXTRAÇÃO DO RNA

O dsRNA dos rotavírus foi extraído de suspensão fecal a 10% por meio da extração de ácido nucleico com sílica-isoltiocianato de guanidina, conforme descrito por Boom et al3.

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)

O perfil do RNA foi analisado por PAGE com coloração prata, conforme descrito anteriormente16,27.

CARACTERIZAÇÃO DOS GENÓTIPOS G E P DE ROTAVÍRUS POR MEIO DE TRANSCRIPTASE REVERSA SEGUIDA DE REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (RT-PCR)

O genótipo VP7 foi determinado por transcrição reversa seguida de PCR multiplex, como já descrito na literatura9,14,18. Dois diferentes grupos de primers específicos foram utilizados para a genotipagem G: pool A, contendo os primers específicos G1 (9T1-1), G2 (9T1-2), G3 (9T-3P), G4 (9T-4) e G9 (9T-B); e pool B, contendo iniciadores específicos para os genótipos G5 (FT5), G6 (DT6), G8 (HT8) e G10 (ET10).

A determinação do genótipo VP4 foi efetuada por meio de RT-PCR seguida de Nesfed-PCR, conforme descrito por Gentsch et al12. Em resumo, o gene completo do VP4 foi submetido à transcriptase reversa, e um fragmento do par de base 876 foi amplificado. Foram utilizados primers específicos para os genótipos P[8] (1T-1), P[4] (2T-1), P[6](3T-1) e P[9] (4T-1).

 

RESULTADOS

EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DA INFECÇÃO POR ROTAVÍRUS DO TIPO G1

A maior frequência de rotavírus do tipo G1 (68%, 232 de 343) foi encontrada durante um levantamento realizado em 2003 em hospitais pediátricos, enquanto que a menor frequência (11%, 31 de 281) foi verificada durante outro levantamento envolvendo crianças hospitalizadas, realizada entre 1998 e 2000 (Tabela 1). A média de idade das 148 crianças infectadas por G1 foi de 13 meses de idade (entre 2 meses e 3 anos), das quais 70 (47%) tinham <1 ano, 68 (46%) encontravam-se na faixa entre 1-2 anos e 10 (7%) tinham >2 anos de idade.

 

 

PAGE DE CEPAS DE G1

Os perfis de RNA foram visualizados em 116 (78%) das 148 amostras de G1 testadas. Três diferentes eletroferotipos longos (L1, L2 e L3) foram identificados com base nas diferenças de migração dos segmentos de gene 2,5 e 10. Quando realizada a comparação do eletroferotipo L1 com o L2, o segmento de gene 2 do L2 migra de forma mais lenta do que o seu correspondente no L1. Já no que se refere ao L3, as diferenças na migração dos segmentos de gene 5 e 10 foram avaliadas em relação ao L1. Outro segmento de gene foi encontrado em uma amostra que apresentava o padrão L1 (Figura 1). O eletroferotipo mais frequente foi o L1 (79%, 92 de 116). O Estudo E forneceu o maior número de amostras aptas a serem submetidas à caracterização por PAGE (96%, 48 de 50).

 

 

GENOTIPAGEM G E P

Foram detectadas 147 amostras contendo especificidade para o tipo G1 e uma amostra apresentando uma infecção mista G1+G4. O genótipo P pôde ser determinado em 130 (88%) amostras. O genótipo P[8] foi a especificidade mais frequente no tocante à proteína VP4 (64% dos casos). Além disso, as infecções mistas P[6] + P[8], P[4] + P[8], P[4] + P[6] e P[4] + P[6] + P[8] foram encontradas em 11 (7%), 11 (7%), 3 (2%) e 1 (0.6%) amostras, respectivamente. A tabela 2 apresenta a caracterização de 148 amostras por PAGE e RT-PCR (genes VP4 e VP7). A combinação G1P[8] com o padrão L1 foi responsável por 45% das infecções.

 

 

DISCUSSÃO

O G1 ainda aparenta ser o genótipo mais prevalente, representando cerca de metade das cepas circulantes no mundo todo29. Em países desenvolvidos, o genótipo G1 apresenta as mais altas frequências (70%-73%), enquanto que em países em desenvolvimento, essas taxas parecem ser mais baixas (36%-57%). Essa diferença pode ser atribuídas à circulação mais frequente de cepas incomuns, bem como à emergência de novos tipos nos países mais pobres13,29.

Nesta pesquisa, a cepa de G1 foi detectada em 41% dos casos envolvendo rotavírus durante os 21 anos de estudos usando diferentes abordagens nas populações investigadas. Os resultados aqui apresentados são semelhantes aos de estudos realizados no Rio de Janeiro, onde 50% das amostras obtidas de crianças com diarreia aguda eram do tipo G133. Parra et al26 identificaram cepas de G1 em 17% dos casos em uma investigação realizada no Paraguai, entre 1998 e 2000. Esta diferença pode estar relacionada à alta prevalência do G4 e à detecção do G9 naquele estudo.

As taxas de rotavírus do tipo G1 variaram entre 11% e 68% nas pesquisas analisadas. As menores taxas foram observadas no período entre 1998 e 2000. Estes resultados são provavelmente relacionados à alta frequência de cepas não tipadas, bem como à emergência do G9 durante este período. Santos et al30 registraram que 79% de todas as amostras analisadas na cidade de Salvador eram do tipo G9. Resultados semelhantes também foram observados em Goiás, onde Costa et al8 detectaram 34% de infecções por rotavírus do tipo G9. Estas descobertas sugerem que a emergência de rotavírus do tipo G9 no Brasil foi seguida de uma grande circulação de cepas com este genótipo.

Ressalte-se que, neste estudo, todas as amostras do tipo G1 apresentaram eletroferotipos longos. Estes perfis de RNA apresentaram três diferentes padrões, o que demonstra a existência de uma grande diversidade de eletroferotipos na região. Todas as variedades foram detectadas nos espécimes dos Estudos B e D, que, por sua vez, apresentaram uma alta frequência de cepas incomuns e não tipadas (dados não apresentados). Luz et al22 detectaram duas variedades de eletroferotipos longos e 19% dos espécimes do tipo G1 caracterizados por um perfil curto, com três variedades circulando entre crianças diarreicas no Estado do Maranhão.

O G1 P[8] já foi considerado em diversos países como o genótipo circulante predominante29. No presente estudo, este genótipo foi detectado em 64% das amostras. Dados semelhantes foram obtidos por Gentsch et al13 e Castello et al6 em investigações realizadas na América Latina. Esses estudos registraram a ocorrência desta cepa em 52% e 40% das infecções por rotavírus, respectivamente. No Brasil, Carmona et al4 detectaram o G1 P[8] em 67% dos espécimes coletados em um período de oito anos em São Paulo.

Nesta análise, foi encontrada uma infecção mista envolvendo o genótipo G (G1+G4). Mascarenhas et al23 analisaram amostras fecais de uma criança recém-nascida hospitalizada com diarreia leve/moderada adquirida em comunidade e observaram a ocorrência da mistura G1 + G4. Kebaabetswe et al17, em um levantamento realizado em Botsuana envolvendo crianças com gastrenterite, detectaram as infecções mistas G1+G2, G1+G8 e G1+G3 + G9 em 6%, 22% e 6% dos casos, respectivamente.

É importante ressaltar a frequência de infecções mistas envolvendo os rotavírus do tipo G1 (17% dos casos). Das et al10 documentaram 30% dos casos com infecções mistas em uma investigação com crianças hospitalizadas na India, apesar de outras amostras do tipo G terem sido descritas. As maiores taxas de infecções mistas foram detectadas principalmente em países em desenvolvimento, devido provavelmente à ocorrência do rearranjo genético de rotavírus, o que pode levar à emergência de novos rotavírus circulantes dos genotipos G e P e de mutantes de escape.

Ao que sabemos, este é o primeiro estudo a abordar a caracterização molecular do rotavírus do tipo G1 no Brasil. Nossos achados fornecem dados que permitirão uma melhor compreensão a respeito da diversidade molecular associada às infecções por este tipo de rotavírus antes do advento da vacina contra rotavírus. Abordagens mais específicas envolvendo o sequenciamento de nucleotídeos podem ser aplicadas para avaliar a circulação de variedades genéticas do tipo G1 e seu possível impacto sobre estratégias de vacinação.

 

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Correspondência / Correspondence / Correspondencia:
Luana da Silva Soares
Instituto Evandro Chagas
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CEP: 67030-000
Ananindeua-Pará-Brasil
Fax + 00 55 91 32142006
E-mail:luanasoares@iec.pa.gov.br

Recebido em / Received / Recibido en: 31/7/2009
Aceito em / Accepted / Aceito en: 25/9/2009