ARTIGO ORIGINAL

Caracterização molecular de norovírus, sapovírus e astrovírus em crianças com gastroenterite aguda em Belém, Pará, Brasil

Glicélia Cruz Aragão; Darleise de Souza Oliveira; Mirleide Cordeiro dos Santos; Joana D'Arc Pereira Mascarenhas; Consuelo Silva de Oliveira; Alexandre da Costa Linhares; Yvone Benchimol Gabbay

Seção de Virologia, Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil

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RESUMO

A importância dos norovírus (NoVs), sapovírus (SaVs) e astrovírus humanos (HAstVs) como causa de surtos de gastroenteritis já está bem definida. Entretanto, poucos estudos têm descrito casos esporádicos de gastroenterites aguda causados por esses agentes. O objetivo deste estudo foi determinar o papel destes vírus na etiologia da gastroenterite aguda em crianças atendidas durante uma vigilância intensiva realizada em hospitais e ambulatórios de Belém, Brasil, de março a setembro de 2003. Um total de 305 espécimes fecais de pacientes com gastrenterite grave foram coletados e testados por reação em cadeia da polimerase precedida de transcrição reversa (RT-PCR), utilizando iniciadores específicos Mon 269 e Mon 270 para os HAstVs; p289 e p290 para os calicivírus humanos (HuCVs); e Mon 431/433 e Mon 432/434 para os NoVs. Sequenciamento dos amplicons de HAstV, HuCVs e NoVs, obtidos por RT-PCR, foi realizado usando os mesmos iniciadores. Das 305 amostras testadas, 96 (31,5%) apresentaram resultados positivos, sendo que 51 diagnosticadas como HuCVs, 40 como HAstVs e cinco infecções mistas. Das 56 (18,4%) amostras de HuCVs sequenciadas, 30 foram NoVs (9,8%) pertencentes aos genogrupos GI-4 e GII-4, e 15 (4,9%) SaVs dos grupos GI-1, GI-2 e GII-1. HAstVs foram detectados em 45 (14,7%) das amostras, incluindo os genótipos 1, 8 e 2. Esta pesquisa ressalta a importância destas viroses como causa de gastrenterite aguda e demonstra a circulação de diferentes genótipos durante o período de estudo. Estes resultados reforçam a necessidade de se estabelecer uma vigilância intensiva das gastrenterite causadas por estes vírus, de forma a poder avaliar o impacto da doença e monitorar os genótipos circulantes.

Palavras-chave: Norovírus; Sapovírus; Astrovírus Humano; Gastroenterite; Dados de Sequência Molecular.

INTRODUÇÃO

A gastrenterite aguda é uma das principais causas de morbimortalidade na infância, especialmente em países em desenvolvimento. Estima-se que mais de um bilhão de casos de diarreia aguda envolvendo crianças e adultos ocorra anualmente no mundo, fato este responsável por uma taxa de mortalidade de cerca de seis milhões entre crianças menores de cinco anos de idade³². Além de bactérias e parasitas, muitos vírus estão associados a esses episódios de gastrenterite. Dentre eles, destacam-se os rotavírus do grupo A, como principal patógeno. No entanto, a importância dos norovírus (NoVs), sapovírus (SaVs), astrovírus humanos (HAstV) e adenovírus entéricos tem aumentado devido à utilização de novas metodologias⁴⁷.

NoVs e SaVs pertencem à família Caliciviridae, e acometem principalmente humanos. São vírus pequenos, não envelopados, com simetria icosaédrica, de RNA de fita simples e polaridade positiva². Análises filogenéticas classificaram os NoVs em cinco genogrupos distintos (GI-GV). Os genogrupos GI, GII e GIV são encontrados em humanos, sendo que o GII tem sido descrito como o mais prevalente mundialmente⁴⁴. Os SaVs são divididos em sete genogrupos (GI-GVII), dentre os quais GI, GII, GIV e GV são conhecidos por infectar o homem³⁴.

Os NoVs são mundialmente considerados como principal causa de surtos de gastrenterite, sendo responsáveis por cerca de 80-90% dos casos, e sua transmissão ocorre principalmente por água e alimentos contaminados. Estudos recentes também descrevem estes vírus como um dos principais responsáveis por casos esporádicos de gastrenterite aguda detectados em hospitais e em comunidades. Os SaVs também têm sido associados tanto a surtos como a casos esporádicos de gastrenterite aguda³³.

Os HAstVs pertencem ao gênero Mamastrovirus (família Astroviridae). Estão associados a surtos, sendo reconhecidos como uma causa comum de gastrenterite não só em crianças, como também em idosos e indivíduos imunocomprometidos²⁷. São vírus pequenos, esféricos (28-30 nm de diâmetro), não envelopados, com polaridade positiva e genoma de RNA poliadenilado de fita simples (ssRNA), de aproximadamente 7 kb de comprimento¹³. Até o momento, já foram descritos oito genótipos de HAstVs (HAstV-1-HAstV-8), sendo HAstV-1 o mais prevalente tanto em países desenvolvidos como em desenvolvimento6^6,46.

A importância dos NoVs, SaVs e HAstVs como causa de surtos de gastrenterite aguda já está bem definida, entretanto poucas pesquisas têm descrito o envolvimento destes vírus em casos esporádicos, especialmente em países em desenvolvimento. Por esta razão, este estudo visa determinar o papel destes agentes na etiologia das gastrenterites agudas. Para isto, foram analisadas amostras fecais de crianças atendidas durante uma vigilância intensiva realizada em hospitais e ambulatórios de Belém de março a setembro de 2003. Os principais objetivos desta vigilância foram criar uma rede envolvendo as unidades de saúde locais e treinar a equipe tanto dos hospitais como do Instituto Evandro Chagas (IEC), visando pesquisas futuras com vacina contra rotavírus do grupo A (RV-A). Este estudo teve como enfoque principal a prevalência desses agentes, bem como sua caracterização molecular, a fim de determinar os genótipos circulantes.

MATERIAIS E MÉTODOS

PACIENTES E ESPÉCIMES

Os espécimes fecais foram coletados de episódios graves de diarreia aguda durante vigilância para RV-A realizada em Belém, Estado do Pará, região norte do Brasil, de março a setembro de 2003. No momento do atendimento, um termo de consentimento foi obtido dos pais ou dos responsáveis legais das crianças participantes. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do IEC. Um levantamento inicial foi conduzido em todos os hospitais pediátricos, ambulatórios e unidades de saúde localizadas em Belém, que forneciam assistência a crianças menores de três anos de idade, principalmente àquelas provenientes de famílias de baixa-renda que viviam sob condições sanitárias precárias e em elevados índices de aglomerados humanos. Foram feitos contatos prévios em todos esses locais e a vigilância das gastrenterites foi realizada por meio de visitas diárias, a fim de detectar qualquer episódio de diarreia, definido por três ou mais evacuações líquidas ou semilíquidas em um período de 24 h, com duração inferior a 14 dias. Um total de 762 amostras fecais foi obtido durante os seis meses de pesquisa. As amostras foram inicialmente testadas quanto à presença dos RV-A e adenovírus entéricos, utilizando "kits" comerciais de ensaio imunoenzimático (EIE). No presente estudo, todos os espécimes negativos para ambos os vírus (305) foram testados para os HAstVs e HuCVs pela reação em cadeia da polimerase precedida da transcrição reversa (RT-PCR).

OBTENÇÃO E AMPLIFICAÇÃO DO RNA VIRAL

O ssRNA viral foi extraído de 300 µL de uma suspensão fecal a 10% utilizando sílica/tiocianato de guanidina, conforme descrito por Boom et al³, incluindo modificações introduzidas por Cardoso et al⁶. Na reação de transcriptase reversa foi usado um iniciador randômico [hexamer pd (N) 6-50 A260 units; Amersham Biosciences] para obtenção do cDNA. Foi realizada a reação de PCR usando os pares de iniciadores Mon 269/270 (região ORF2) para os HastVs³⁰ e p289/290 (região da RNA polimerase) para os HuCVs²³. Os produtos obtidos por RT-PCR foram aplicados em gel de agarose a 1%, corados com brometo de etídio e fotografados em aparelho Gel Doc 1000 (BioRad). As amostras que apresentaram fragmentos específicos de 449 pb, 319 pb e 331 pb, foram consideradas positivas para HAstVs, NoVs e SaVs, respectivamente. Amostras positivas para HAstVs e HuCVs e água Milli-Q estéril foram incluídas em todas as reações como controles positivos e negativo, respectivamente. Algumas amostras que apresentaram baixa concentração de produto (bandas fracas) com os iniciadores para HuCVs também foram testadas com os iniciadores Mon 432/434 e Mon 431/433 (região da RNA polimerase), específicos para os NoVs dos genogrupos GI e GII, respectivamente¹¹.

SEQUENCIAMENTO DOS AMPLICONS DE HASTVS, HUCVS E NOVS OBTIDOS POR RT-PCR

Os produtos foram purificados com o "kit" de extração de gel QiaQuick^® (QIAGEN), conforme orientação do fabricante, e quantificados em gel de agarose a 1% com o marcador de peso molecular "Low DNA Mass Ladder" (Invitrogen). As sequências de nucleotídeos foram determinadas por ciclo direto usando o "Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" (Applied Biosystems) com os iniciadores Mon 269 e Mon 270 para HAstVs, p289 e p209 para HuCVs e Mon 431/433 e Mon 432/434 para NoVs. Os fragmentos amplificados foram purificados por precipitação com isopropanol (60 e 70%). Os produtos foram analisados no sequenciador automático "3130X/Genetic Analyzer" (AB Applied Biosystems/Hitachi).

ANÁLISE FILOGENÉTICA

Os dados das sequências de ambas as fitas foram alinhados e editados usando o programa "BioEdit Sequence Alignment Editor" (v. 7.0.5.3) e comparados com outras sequências padrão disponíveis no Banco de dados (GenBank). Os dendrogramas foram construídos utilizando o método de Neighbor-Joining (NJ) e software MEGA, versão 4.0⁴². A análise do "Bootstrap" foi realizada com 2 mil réplicas¹⁴.

NÚMERO DE ACESSO DAS SEQUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS

As sequências de nucleotídeos determinadas neste estudo foram depositadas no banco de dados "GenBank" com os seguintes números de acesso: GU012316 a GU012345 para NoVs, GQ984294 a GQ984308 para SaVs e GQ920650 a GQ920672 para HAstVs.

RESULTADOS

De um total de 305 amostras testadas por RT-PCR, 96 (31,5%) apresentaram resultados positivos, sendo 51 classificadas como HuCVs, 40 como HAstVs e cinco infecções mistas. Dos 56 (1 8,4%) espécimes positivos para HuCVs, 45 foram sequenciados: 30 (66,7%) classificados como NoVs, genogrupos GI-4 (1; 3,3%) e GII-4 (29; 96,7%), e 15 (33,3%) como SaVs, genogrupos GI-1 (3; 20%), GI-2 (2; 13,3%) e GII-1 (10; 66,7%) (Figura 1, Tabela 1). As 11 amostras que apresentaram um fragmento amplificado com baixa concentração (banda fraca) na PCR foram testadas novamente usando iniciadores específicos para NoVs; em oito foram observados fragmentos específicos e três foram negativas. Após sequenciamento, apenas uma amostra resultou positiva para o genogrupo GII-4, e nas outras sete, como alguns nucleotídeos não puderam ser definidos, suas cepas não foram incluídas no dendrograma. Das 45 (14,7%) amostras classificadas como HAstVs, 37 (82,2%) pertenciam ao genótipo 1, quatro (8,9%) ao genótipo 8, duas (4,4%) ao genótipo 2 e duas (4,4%) não foram sequenciadas (Figura 2, Tabela 1). Observaram-se cinco infecções mistas: quatro envolvendo NoV/GII-4 e HAstV-1 e uma SaV/GII-1 e HAstV-8.

As amostras classificadas como NoVs/GII-4 foram agrupadas em três sub-linhagens distintas: GII-4b "Nova variante" (2/29; 6,9%), GII-4c (26/29; 89,6%) e GII-4d (1/29; 3,4%). A divergência média observada entre as amostras classificadas como NoV GII-4c e GII-4b "Nova variante" foi de 0,5% e 2,9%, respectivamente, e com o protótipo específico foi de 3,1% (GII-4b "Nova variante"), 3% (GII-4c), 4,9% (GII-4d) e 11,3% (GI-4). As análises envolvendo somente amostras de Belém demonstraram uma divergência média de 9,6% entre GII-4c e GII-4d, e 16,4% entre GII-4b e GII-4d. Em relação à GI-4, esta variação foi maior que 49,3%. Uma pequena divergência foi observada quando os espécimes classificados no genogrupo GII-4 foram analisados com relação à sequência de aminoácidos (dados não mostrados).

Entre os SaVs, uma variação mínima foi observada dentro de cada um dos três genogrupos detectados: GII-1 (0,9%), GI-2 (0,3%) e GI-1 (3,1%). Em relação aos protótipos, a divergência média foi: GII-1 (4,1%), GI-2 (10,3%) e GI-1 (10,3%). Usando a sequência de aminoácidos do protótipo Bristol (AJ 249939; aminoácido 1460 a 1555) como referência, muitas substituições foram notadas, caracterizando os diversos genogrupos/genótipos analisados. Contudo, nenhuma substituição exclusiva foi observada com relação às amostras de Belém (dados não mostrados).

Todas as cepas de HAstV detectadas neste estudo pertenciam à linhagem 1a e divergiram de 0 - 3,6% (média de 0,6%) e 2,7% em relação ao protótipo Oxford HAstV-1. Nenhuma substituição significante de aminoácido foi observada para a região analisada (dados não mostrados).

Os espécimes deste estudo foram provenientes de 21 hospitais e 11 unidades de saúde. A comparação das taxas de positividade obtidas nos hospitais para NoVs (13,2% -37/281), SaVs (5,3% - 15/281) e HAstVs (14,6% -41/281) com as das unidades de saúde - 4,2% (1/24), 0% e 16,7% (4/24), respectivamente - não revelou diferença estatística significante quando aplicado o teste de Fisher (p <0.05). No entanto, quando considerados juntos NoVs e SaVs (como HuCVs), esta diferença foi significante (p = 0.04).

A tabela 2 demonstra a percentagem de positividade obtida para NoVs, SaVs e HAstVs em casos de gastrenterites observados durante o período de estudo (março a setembro de 2003). Verificaram-se picos de incidência para NoVs em maio (13/43; 30,2%); SaVs em junho (4/50; 8,0%) e julho (5/64; 7,8%); e HAstVs em março (8/16; 50%) e julho (14/64; 21,9%).

A distribuição por faixa etária dos casos positivos para NoVs e SaVs e HAstVs estão demonstrados na tabela 3. A maior taxa de detecção para os NoVs foi verificada em crianças com 6 a 12 meses de idade (17,1%), e, para os SaVs, a faixa etária foi maior, 24 a 30 meses (10,7%). Com relação aos HAstVs as taxas foram semelhantes (19,0% e 18,2%) para as idades de 0 a 6 e 12 a18 meses de vida.

A maioria dos espécimes foi coletada no período de 42 h da hospitalização ou do atendimento nas unidades de saúde. Os principais sintomas observados nos casos positivos para essas viroses foram: diarreia, vômitos, febre e desidratação, porém sintomas similares foram observados nos casos negativos (dados não mostrados).

DISCUSSÃO

No presente estudo, pelo menos um agente viral foi detectado em 31,5% das amostras testadas. Esse resultado foi um pouco superior à taxa de 29% encontrada em uma vigilância conduzida durante cinco anos na Província de Gyeonggi, Coréia do Sul²². As taxas de detecção obtidas em Belém para HuCVs, NoVs, SaVs e HAstVs foram de: 18,4%, 12,5%, 4,9% e 14,7%, respectivamente. Em hospitais de Campo Grande (7,6%), Goiânia e Brasília-DF (8,6%) e Salvador (9%), as taxas obtidas para os HuCVs foram inferiores às registradas em Belém^1,4,48. Quanto aos NoVs, a positividade observada (12,5%) foi menor que as registradas em crianças da Coréia (36,2%) e Espírito Santo (39,7%), porém semelhante às encontradas em dois estudos conduzidos no Rio de Janeiro (14,5% e 20%) e São Paulo (15,7%) e superiores às de uma pesquisa realizada na Tailândia (6,5%)^{24,26,28,37,41,44}.

A investigação de SaVs no Brasil ainda é limitada em razão da maioria dos trabalhos utilizarem iniciadores específicos para os NoVs. Contudo, estes vírus já foram detectados em uma amostra de Salvador (0,7%) e descritos em espécimes diarréicos coletados em um hospital (5,9%) e em uma unidade de saúde (3%) de Belém em percentuais similares ao do estudo atual (4,9%)^29,40,48. Este percentual foi semelhante aos relatados na Tailândia e Austrália (4,8% e 4,1%, respectivamente) e menor que os da índia (10,2%)^20,21,35. Nesta pesquisa, três amostras que se apresentaram positivas para HuCVs, foram negativas para NoVs (quando se utilizou iniciadores específicos), sugerindo que elas provavelmente pertenciam ao gênero SaVs, o que aumentaria a taxa de detecção desses vírus para 5,9%.

A taxa de positividade para os HAstV (14,7%) foi semelhante às registradas em ambulatórios e/ou hospitais da Coréia do Sul, Cidade de Córdoba e Rio de Janeiro (11,%, 12,4% e 14%, respectivamente)^19,22,45. Este percentual foi maior que os obtidos anteriormente em diferentes estudos conduzidos em Belém durante 18 anos envolvendo hospitais, unidade de saúde, comunidade e creche, que variaram entre 2,7% e 9,9%¹⁵.

O dendrograma de NoVs mostrado no presente estudo foi construído com base nas sequências obtidas com os iniciadores 289/290, que codificam parte da RNA polimerase, e que foram usados por detectarem tanto os NoVs como os SaVs. Em contrapartida, a maioria dos estudos realizados no Brasil utiliza outros pares de iniciadores que amplificam a região B da RNA polimerase e são específicos para NoVs. Como esses iniciadores codificam a mesma região da RNA polimerase, foi possível comparar os resultados desta pesquisa com outras conduzidas no Brasil. No presente estudo, o genogrupo GII-4 foi detectado em 96,7% das amostras analisadas. Estes resultados confirmam os obtidos no Rio de Janeiro (64%) e em São Paulo (76,9%)^7,44. Este genogrupo também foi o mais encontrado em amostras coletadas em Belém nos anos de 1992-1994 e 1998-2000 (dados não mostrados). Muitos artigos relatam um aumento significativo na circulação de cepas de GII-4 desde a década de 1990, com uma grande variabilidade genética, relacionados tanto a surtos extensivos como a casos esporádicos^5,31,43.

Três diferentes genogrupos de SaVs foram encontrados neste estudo, sendo o GII-1 o mais prevalente (66,7%). Este também foi detectado em uma amostra de Salvador, o único outro lugar no Brasil em que este vírus foi descrito⁴⁸. No entanto, em estudos realizados anteriormente em Belém⁴⁰, o genogrupo mais frequente foi o GI-1. Uma ocorrência semelhante desta cepa também foi observada em Bangladesh, em crianças diarreicas⁸.

Três diferentes genótipos de HAstVs cocircularam em Belém durante os seis meses de estudo, sendo HAstV-1 o mais prevalente (82,2%), como também relatado em outros locais^6,16,39,45. A circulação simultânea de outros genótipos foi observada em outras regiões do Brasil e do mundo^6,10,36,39. Todas as amostras positivas para HAstVs-1 foram classificadas como sendo da linhagem 1a. Pesquisas anteriores realizadas em Belém demonstraram que 93,8% (76/81) das cepas de HAstVs-1 detectadas ao longo de 18 anos (1982-2000) pertenciam à linhagem 1a¹⁵. Porém, estudos conduzidos em outras localidades do Brasil, como nas cidades do Rio de Janeiro e Goiânia, de 2003 a 2005, demonstraram a circulação da linhagem 1d^38,45. Os dados obtidos neste trabalho, a partir de amostras coletadas em 2003, mostraram que não ocorreu nenhuma alteração em Belém, visto que a linhagem 1a continuou sendo a única em circulação. Vale ressaltar que o HAstVs tipo 8 foi encontrado em 8,9% das amostras. Este genótipo é considerado raro, embora já tenha sido observado em outros estudos realizados em Belém, porém em menor frequência. Resultados semelhantes foram observados no Rio de Janeiro^17,45.

Coinfecção envolvendo os três vírus foi verificada em 1,6% dos casos. Esta situação é relativamente comum em episódios de gastrenterite, conforme descrito por outros autores^{9,18,25,36,44}. Este fato provavelmente reflete as precárias condições de saneamento e o baixo nível socioeconômico a que essas crianças pertencem.

Este estudo envolveu amostras coletadas em hospitais e unidades de saúde. Foi observada uma maior frequência destes vírus nos nosocômios, o que indica maior gravidade da associação desses agentes a quadros de gastrenterite. No entanto, o número de espécimes (42) coletados nas unidades de saúde foi muito pequeno para permitir uma melhor análise.

Observou-se também que os NoVs foram mais prevalentes entre crianças de 6 a 12 meses, enquanto que os SaVs o foram entre as de 24-30 meses de idade. Estes dados estão de acordo com os descritos na literatura, o que indica que os SaVs são mais frequentemente detectados em crianças de maior idade¹². Um padrão de sazonalidade para esses três agentes não pôde ser definido porque este estudo envolveu somente seis meses de vigilância.

Deste modo, os dados obtidos demonstram a importância destes vírus nos casos de gastrenterite aguda tanto em hospitais como em unidades de saúde. A detecção de SaVs reforça a necessidade de se estabelecer um sistema de monitoramento para avaliar o impacto destes vírus em outras regiões do Brasil. A caracterização molecular desses agentes demonstrou que diferentes genótipos circulam ao longo do tempo (ou seja, não foram os mesmos nesta pesquisa e em outras previamente realizadas em Belém). Portanto, estudos moleculares adicionais são necessários para monitorar essas variações. A introdução recente de vacina para RV-A no Programa Nacional de Imunização Pediátrica do Brasil reforça a necessidade de investigações permanentes sobre estas viroses.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos o apoio técnico prestado por Maria Silvia Sousa de Lucena, Jones Anderson Monteiro Siqueira, Ian Carlos Lima, Dielle Monteiro Teixeira e Jefferson Oliveira, bem como a toda equipe de campo e aos médicos que trabalharam durante o projeto "Vigilância Intensiva das Diarréias em Hospitais". Este trabalho teve o apoio financeiro do IEC/SVS/MS.

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Corresponding / Correspondência / Correspondencia:
Yvone Benchimol Gabbay
Instituto Evandro Chagas, Seção de Virologia
Rodovia BR316, km 7, s/nº, Levilândia
CEP: 67.030-000 Ananindeua, Pará, Brasi
E-mail:yvonegabbay@iec.pa.gov.br

Recebido em / Received / Recibido en: 31/7/2009
Aceito em / Accepted / Aceito en: 19/10/2009