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Revista Pan-Amazônica de Saúde

versão On-line ISSN 2176-6223

Rev Pan-Amaz Saude v.1 n.1 Ananindeua mar. 2010

http://dx.doi.org/10.5123/S2176-62232010000100021 

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Caracterización molecular de norovirus, sapovirus y astrovirus en niños con gastroenteritis aguda en Belém (Pará, Brasil)

 

 

Glicélia Cruz Aragão; Darleise de Souza Oliveira; Mirleide Cordeiro dos Santos; Joana D'Arc Pereira Mascarenhas; Consuelo Silva de Oliveira; Alexandre da Costa Linhares; Yvone Benchimol Gabbay

Seção de Virologia, Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil

Endereço para correspondência
Correspondence
Dirección para correspondencia

 

Título original: Molecular characterization of norovirus, sapovirus and astrovirus in children with acute gastroenteritis from Belém, Pará, Brazil. Traducido por: Rocio Tamara (resumen) y Lota Moncada (artículo)

 

 


RESUMEN

La importancia de los norovirus (NoVs), sapovirus (SaVs) y astrovirus humanos (HAstVs) como causa de brotes de gastroenteritis ya está bien definida. Sin embargo, pocos estudios han descrito casos esporádicos de gastroenteritis aguda causados por esos agentes. El objetivo de este estudio fue el de determinar el papel de esos virus en la etiología de las gastroenteritis agudas en niños atendidos durante una vigilancia intensiva realizada en hospitales y ambulatorios de Belém, Brasil, de marzo a setiembre de 2003. Un total de 305 especímenes fecales de pacientes con gastroenteritis grave fueron colectados y analizados por reacción en cadena de polimerasa precedida de transcripción reversa (RT-PCR), utilizando iniciadores específicos Mon 269 y Mon 270 para los HAstVs; p289 y p290 para los calicivirus humanos (HuCVs); y Mon 431/433 y Mon 432/434 para los NoVs. Secuenciación de los amplicones de HAstV, HuCV y NoV, obtenidos por RT-PCR, se realizó usando los mismos iniciadores. De las 305 muestras analizadas, 96 (31,5%) fueron positivas, 51 diagnosticadas como HuCVs, 40 como HAstVs y cinco infecciones mixtas. De las 56 (18,4%) muestras de HuCVs secuenciadas, 30 fueron NoVs (9,8%) pertenecientes a los genogrupos GI-4 y GII-4, y 15 (4,9%) fueron SaVs de los grupos GI-1, GI-2 y GII-1. HAstVs fueron detectados en 45 (14,7%) muestras, incluyendo los genotipos 1, 8 y 2. Esta investigación resalta la importancia de estas virosis como causa de gastroenteritis aguda y demuestra la circulación de diferentes genotipos durante el período de estudio. Estos resultados refuerzan la necesidad de establecer una vigilancia intensiva de las gastroenteritis causadas por estos virus, de forma a poder evaluar el impacto de la enfermedad y monitorear los genotipos circulantes.

Palabras clave: Norovirus; Sapovirus; Astrovirus Humano; Gastroenteritis; Datos de Secuencia Molecular.


 

 

INTRODUCCIÓN

La gastroenteritis aguda es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en la infancia, especialmente en países en desarrollo. Se estima que más de mil millones de casos de diarrea aguda involucrando a niños y adultos ocurra anualmente en el mundo, hecho responsable por una tasa de mortalidad de cerca de seis millones, entre niños menores de cinco años de edad32.

Además de bacterias y parásitos, muchos virus están asociados a esos episodios de gastroenteritis. Entre ellos, se destacan los rotavirus del grupo A, como principal patógeno. Sin embargo, la importancia de los norovirus (NoVs), sapovirus (SaVs), astrovirus humanos (HAstV) y los adenovirus entéricos ha aumentado debido a la utilización de nuevas metodologías47.

NoVs y SaVs pertenecen a la familia Caliciviridae, y acometen principalmente a humanos. Son virus pequeños, no envueltos, con simetría icosahédrica, de RNA de cadena sencilla y polaridad positiva2. Análisis filogenéticos clasificaron a los NoVs en cinco genogrupos distintos (GI-GV). Los genogrupos GI, GII y GIV se encuentran en humanos, siendo que el GII ha sido descrito como el más prevalente a nivel mundial44. Los SaVs se dividen en siete genogrupos (GI-GVII), entre los que el GI, GII, GIV y GV son conocidos por infectar al hombre34.

Los NoVs son mundialmente considerados como principal causa de brotes de gastroenteritis, siendo responsables por cerca de 80-90% de los casos, y su transmisión ocurre principalmente a través del agua y de alimentos contaminados. Estudios recientes también describen estos virus como uno de los principales responsables por casos esporádicos de gastroenteritis aguda detectados en hospitales y en comunidades. Los SaVs también han sido asociados tanto a brotes como a casos esporádicos de gastroenteritis aguda33.

Los HAstVs pertenecen al género Mamastrovirus (familia Astroviridae). Están asociados a brotes, siendo reconocidos como causa común de gastroenteritis no apenas en niños, sino también en ancianos e individuos inmunocomprometidos27. Son virus pequeños, esféricos (28-30 nm de diámetro), no envueltos, con polaridad positiva y genoma de RNA poliadenilado de cadena sencilla (ssRNA), de aproximadamente 7kb de largo13. Hasta el momento, han sido descritos ocho genotipos de HAstVs (HAstV-1-HAstV-8), siendo HAstV-1 el más prevalente, tanto en países desarrollados como en los en desarrollo6,46.

La importancia de los NoVs, SaVs y HAstVs como causa de brotes de gastroenteritis aguda ya está bien definida, sin embargo, pocas investigaciones han descrito el comprometimiento de estos virus en casos esporádicos, especialmente en países en desarrollo. Por este motivo, este estudio tiene como objetivo determinar el papel de estos agentes en la etiología de las gastroenteritis agudas. Para ello, han sido analizadas muestras fecales de niños atendidos durante una vigilancia intensiva realizada en hospitales y ambulatorios de Belém, de marzo a setiembre de 2003. Los principales objetivos de esta vigilancia fueron: crear una red que abarcase a las unidades de salud locales y entrenar equipos, tanto de los hospitales como del Instituto Evandro Chagas (IEC), para investigaciones futuras de vacuna contra rotavirus del grupo A (RV-A). Este estudio tuvo como foco principal la prevalencia de estos agentes, bien como su caracterización molecular, con el fin de determinar los genotipos circulantes.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

PACIENTES Y ESPECÍMENES

Los especímenes oriundos de muestras fecales se colectaron en episodios graves de diarrea aguda durante vigilancia para RV-A realizada en Belém, Estado de Pará, región norte de Brasil, de marzo a setiembre de 2003. Al momento de la atención, se obtuvo de los padres o responsables legales de los niños participantes, un término de consentimiento. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del IEC. Un análisis inicial fue realizado en todos los hospitales pediátricos, ambulatorios y unidades de salud localizadas en Belém, que ofrecían asistencia a niños menores de tres años, principalmente a aquellos provenientes de familias de baja renta, que vivían en condiciones sanitarias precarias y en elevados índices de aglomerados humanos. Se realizaron contactos previos en todos esos locales y la vigilancia de las gastroenteritis se realizó en visitas diarias, con el fin de detectar cualquier episodio de diarrea, definido por tres o más evacuaciones líquidas o semilíquidas en un período de 24h, con duración inferior a 14 días. Se obtuvo un total de 762 muestras fecales durante los seis meses de investigación. Las muestras fueron inicialmente analizadas con relación a la presencia de los RV-A y adenovirus entéricos, utilizando "kits" comerciales de ensayo inmunoenzimático (EIE). En el presente estudio, todos los especímenes negativos para ambos virus (305) fueron analizados para los HAstVs y HuCVs por la reacción en cadena de la polimerasa precedida de la transcripción reversa (RT-PCR).

OBTENCIÓN Y AMPLIFICACIÓN DEL RNA VIRAL

El ssRNA viral se extrajo de 300 µL de una suspensión fecal a 10% utilizándose para esto sílica/tiocianato de guanidina, conforme descrito por Boom et al3, incluyendo modificaciones introducidas por Cardoso et al6. En la reacción de transcriptasa reversa fue usado un iniciador aleatorio [hexamer pd (N) 6-50 A260 units; Amersham Biosciences] para obtención del cDNA. Fue realizada a reacción de PCR usando los pares de iniciadores Mon 269/270 (región ORF2) para los HastVs30 y p28293/290 (región de la RNA polimerasa) para los HuCVs23. Los productos obtenidos por RT-PCR fueron aplicados en gel de agarosa a 1%, teñidos con bromuro de etidio y fotografiados en aparato Gel Doc 1000 (BioRad). Las muestras que presentaron fragmentos específicos de 449 pb, 319 pb y 331 pb, fueron consideradas positivas para HAstVs, NoVs y SaVs, respectivamente. Muestras positivas para HAstVs y HuCVs y agua Milli-Q estéril fueron incluidas en todas las reacciones como controles positivos y negativo, respectivamente. Algunas muestras que presentaron baja concentración de producto (bandas débiles) con los iniciadores para HuCVs también fueron analizadas con los iniciadores Mon 432/434 e Mon 431/433 (región de la RNA polimerasa), específicos para los NoVs de los genogrupos GI y GII, respectivamente11.

SECUENCIACIÓN DE LOS AMPLICONS DE HASTVS, HUCVS Y NOVS OBTENIDOS POR RT-PCR

Los productos fueron purificados con el "kit" de extracción de gel QiaQuick® (QIAGEN), conforme orientación del fabricante, y cuantificados en gel de agarosa a 1% con el marcador de peso molecular "Low DNA Mass Ladder" (Invitrogen). Las secuencias de nucleotideos fueron determinadas por ciclo directo usando el "Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" (Applied Biosystems) con los iniciadores Mon 269 y Mon 270 para HAstVs, p289 y p209 para HuCVs y Mon 431/433 y Mon 432/434 para NoVs. Los fragmentos amplificados fueron purificados por precipitación con isopropanol (60 y 70%). Los productos fueron analizados en el secuenciador automático "3130X/Genetic Analyzer" (AB Applied Biosystems/ Hitachi).

ANÁLISIS FILOGENÉTICA

Los datos de las secuencias de ambas cintas fueron alineados y editados usando el programa BioEdit Sequence Alignment Editor (v. 7.0.5.3) y comparados a otras secuencias estándar disponibles en el banco de datos (GenBank). Los dendrogramas fueron construidos utilizando el método de Neighbor-Joining (NJ) y software MEGA, versión 4.042. El análisis del "Bootstrap" fue realizado con 2.000 réplicas14.

NÚMERO DE ACCESO DE LAS SECUENCAS DE NUCLEOTIDEOS

Las secuencias de nucleotideos determinadas en este estudio fueron depositadas en el banco de datos "GenBank" con lo siguientes números de acceso: GU012316 a GU012345 para NoVs, GQ984294 a GQ984308 para SaVs y GQ920650 a GQ920672 para HAstVs.

 

RESULTADOS

De un total de 305 muestras analizadas por RT-PCR, 96 (31,5%) presentaron resultados positivos, siendo 51 clasificadas como HuCVs, 40 como HAstVs y cinco infecciones mixtas. De los 56 (18,4%) especímenes positivos para HuCVs, 45 fueron secuenciados: 30 (66,7%) clasificados como NoVs, genogrupos GI-4 (1; 3,3%) y GII-4 (29; 96,7%), y 15 (33,3%) como SaVs, genogrupos GI-1 (3; 20%), GI-2 (2; 13,3%) y GII-1 (10; 66,7%)  (Figura  1, Tabla  1).  Las  11   muestras que presentaron un fragmento amplificado con baja concentración (banda débil) en la PCR fueron nuevamente analizadas, con el uso de iniciadores específicos para NoVs; en ocho se observaron dos fragmentos específicos y tres fueron negativos. Luego de la secuenciación, tan sólo una muestra resultó positiva para el genogrupo GII-4; con relación a las otras siete, como algunos nucleotideos no pudieron ser definidos, sus cepas no fueron incluidas en el dendrograma. De las 45 (14,7%) muestras clasificadas como HAstVs, 37 (82,2%) pertenecían al genotipo 1,4 (8,9%) al genotipo 8, 2 (4,4%) al genotipo 2 y 2 (4,4%) no fueron secuenciadas (Figura 2, Tabla 1). Se observaron cinco infecciones mixtas: cuatro involucrando NoV/GII-4 y HAstV-1 y una SaV/GII-1 y HAstV-8.

 

 

 

 

 

 

Las muestras clasificadas como NoVs/GII-4 se agruparon en tres sublinajes distintos: GII-4b "nueva variante" (2/29; 6,9%), GII-4c (26/29; 89,6%) y GII-4d (1/29; 3,4%). La divergencia promedio observada entre las muestras clasificadas como NoV GII-4c e GII-4b "nueva variante" fue de 0,5% y 2,9%, respectivamente, y, con el prototipo específico, fue de 3,1% (GII-4b "nueva variante"), 3% (GII-4c), 4,9% (GII-4d) y 11,3% (GI-4). Los análisis abarcando solamente muestras de Belém demostraron una divergencia promedio de 9,6% entre GII-4c y GII-4d, y 16,4% entre GII-4b y GII-4d. En relación a GI-4, esta variación fue mayor que 49,3%. Una pequeña divergencia se observó cuando fueron analizados los especímenes clasificados en el genogrupo GII-4, con relación a la secuencia de aminoácidos (datos no mostrados).

Entre los SaVs, una variación mínima fue observada dentro de cada uno de los tres genogrupos detectados: GII-1 (0,9%), GI-2 (0,3%) y GI-1 (3,1%). En relación a los prototipos, la divergencia promedio fue: GII-1 (4,1%), GI-2 (10,3%) y GI-1 (10,3%). Usando la secuencia de aminoácidos del prototipo Bristol (AJ 249939; aminoácido 1460 a 1555) como referencia, fueron notadas muchas sustituciones, caracterizando a los diversos genogrupos/genotipos analizados. Sin embargo ninguna sustitución exclusiva se observó con relación a las muestras de Belém (datos no mostrados).

Todas las cepas de HAstV detectadas en este estudio pertenecían al linaje I y hubo una divergencia de 0 - 3,6% (promedio de 0,6%) y 2,7% en relación al prototipo Oxford HAstV-1. Ninguna sustitución significante de aminoácido fue observada para la región analizada (datos no mostrados).

Los especímenes de este estudio fueron provenientes de 21 hospitales y 11 unidades de salud. La comparación de las tasas de positividad obtenidas en los hospitales para NoVs (13,2% - 37/281), SaVs (5,3% - 15/281) y HAstVs (14,6% - 41/281) con las unidades de salud - 4,2% (1/24), 0% y 16,7% (4/24), respectivamente - no reveló diferencia estadística significativa cuando aplicado el test de Fisher (p <0.05). Sin embargo, cuando considerados juntos NoVs y SaVs (como HuCVs), esta diferencia fue significante (p = 0.04).

La tabla 2 demuestra el porcentaje de positividad obtenido para NoVs, SaVs y HAstVs en casos de gastroenteritis observados durante el período de estudio (marzo a setiembre de 2003). Se verificaron picos de incidencia para NoVs en mayo (13/43; 30,2%); SaVs en junio (4/50; 8,0%) y julio (5/64; 7,8%); y HAstVs en marzo (8/16; 50%) y julio (14/64; 21,9%).

 

 

La distribución por franja etaria de los casos positivos para NoVs y SaVs y HAstVs está demostrada en la tabla 3. La mayor tasa de detección para los NoVs se verificó en niños de 6 a 12 meses de edad (17,1%), y, para los SaVs, la franja etaria fue más alta, 24 a 30 meses (10,7%). Con relación a los HAstVs las tasas fueron semejantes (19,0% e 18,2%) para las edades de 0 a 6 y 12 a 18 meses de vida.

 

 

La mayoría de los especímenes se colectó en el período de 42 h de la hospitalización o de la atención en las unidades de salud. Los principales síntomas observados en los casos positivos para esas virosis fueron: diarrea, vómitos, fiebre y deshidratación, pero síntomas similares fueron observados en los casos negativos (datos no mostrados).

 

DISCUSIÓN

En el presente estudio, por lo menos un agente viral fue detectado en 31,5% de las muestras analizadas. Ese resultado fue un poco superior a la tasa de 29% encontrada en una vigilancia realizada durante cinco años en la Provincia de Gyeonggi, Corea del Sur22. Las tasas de detección obtenidas en Belém para HuCVs, NoVs, SaVs y HAstVs fueron de: 18,4%, 12,5%, 4,9% y 14,7%, respectivamente. En hospitales de Campo Grande (7,6%), Goiânia y Brasília-DF (8,6%) y Salvador (9%), las tasas obtenidas para los HuCVs fueron inferiores a las registradas en Belém1,4,48. Con relación a los NoVs, la positividad observada (12,5%) fue menor que la registrada en niños de Corea (36,2%) y Espírito Santo (39,7%), pero semejante a la encontrada en dos estudios realizados en Rio de Janeiro (14,5% e 20%) y São Paulo (15,7%) y superior a la de una investigación realizada en Tailandia (6,5%)24,26,28,37,41,44.

La investigación de SaVs en Brasil todavía es limitada en virtud de que la mayoría de los trabajos utilizan iniciadores específicos para los NoVs. Sin embargo, estos virus ya han sido detectados en una muestra de Salvador (0,7%) y descritos en especímenes diarreicos colectados en un hospital (5,9%) y en una unidad de salud (3%) de Belém en porcentajes similares a los del estudio actual (4,9%)29,40,48. Este porcentaje fue semejante a los relatados en Tailandia y Australia (4,8% y 4,1%, respectivamente) y menor que los de India (10,2%)20,21,35. En esta investigación, tres muestras que se presentaron positivas para HuCVs, fueron negativas para NoVs (cuando se utilizaron iniciadores específicos), sugiriendo que, probablemente, pertenecían al género SaVs, lo que aumentaría la tasa de detección de esos virus para 5,9%.

La tasa de positividad para los HAstV (14,7%) fue semejante a las registradas en ambulatorios y/u hospitales de Corea del Sur, Ciudad de Córdoba y Rio de Janeiro (11,%, 12,4% y 14%, respectivamente)19,22,45. Este porcentaje fue mayor que los obtenidos anteriormente en diferentes estudios realizados en Belém durante 18 años abarcando hospitales, unidades de salud, comunidades y guarderías, que variaró entre 2,7% y 9,9%15.

El dendrograma de NoVs mostrado en el presente estudio se construyó en base a las secuencias obtenidas con los iniciadores 289/290, que codifican parte de la RNA polimerasa, y que fueron usados por detectar tanto los NoVs como los SaVs. En contrapartida, la mayoría de los estudios realizados en Brasil utiliza otros pares de iniciadores que amplifican la región B de la RNA polimerasa y son específicos para NoVs. Como esos iniciadores codifican la misma región de la RNA polimerasa, fue posible comparar los resultados de esta investigación con otras realizadas en Brasil. En el presente estudio, el genogrupo GII-4 fue detectado en un 96,7% de las muestras analizadas. Estos resultados confirman los obtenidos en Rio de Janeiro (64%) y en São Paulo (76,9%)7,44. Este genogrupo también fue el más encontrado en muestras colectadas en Belém en los años de 1992­1994 y 1998-2000 (datos no mostrados). Muchos artículos relatan un aumento significativo en la circulación de cepas de GII-4 desde la década de 1990, con una gran variabilidad genética, relacionados tanto a brotes extensivos como a casos esporádicos5,31,43.

Tres diferentes genogrupos de SaVs fueron encontrados en este estudio, siendo el GII-1 el más prevalente (66,7%). Este también fue detectado en una muestra de Salvador, el único otro lugar en Brasil en que este virus ha sido descrito48. Sin embargo, en estudios realizados anteriormente en Belém, el genogrupo más frecuente fue el GI-140. También fue observada una ocurrencia semejante de esta cepa en Bangladesh, en niños diarreicos8.

Tres diferentes genotipos de HAstVs cocircularon en Belém durante los seis meses de estudio, siendo HAstV-1 el más prevalente (82,2%), como también relatado en otros locales6,16,39,45. La circulación simultánea de otros genotipos se observó en otras regiones de Brasil y del mundo6,10,36,39. Todas las muestras positivas para HAstVs-1 fueron clasificadas  como  siendo  del   linaje   I.  Anteriores investigaciones realizadas en Belém demostraron que un 93,8% (76/81) de las cepas de HAstVs-1 detectadas a lo largo de 18 años (1982-2000) pertenecían al linaje 115. Sin embargo, estudios conducidos en otras localidades de Brasil, como en las ciudades do Rio de Janeiro y Goiânia, de 2003 a 2005, demostraron la circulación del linaje 1d38,45. Los datos obtenidos en este trabajo, a partir de muestras colectadas en 2003, mostraron que no hubo ninguna alteración en Belém, visto que el linaje 1 continuó siendo el único en circulación. Vale destacar que el HAstVs tipo 8 fue encontrado en 8,9% de las muestras. Este genotipo es considerado raro, aunque ya haya sido observado en otros estudios realizados en Belém, con menor frecuencia. Resultados semejantes se observaron en Rio de Janeiro17,45.

Se verificó coinfección involucrando a los tres virus en un 1,6% de los casos. Esta situación es relativamente común en episodios de gastroenteritis, conforme a lo descrito por otros autores9,18,25,36,44. Este hecho probablemente refleja las precarias condiciones de saneamiento y el bajo nivel socioeconómico en que viven esos niños.

Este estudio abarcó muestras colectadas en hospitales y unidades de salud. Fue observada una mayor frecuencia de estos virus en los nosocomios, lo que indica mayor gravedad en la asociación de esos agentes a cuadros de gastroenteritis. Sin embargo, el número de especímenes (42) colectados en las unidades de salud fue muy pequeño como para permitir un mejor análisis.

Fue observado también que los NoVs fueron más prevalentes entre niños de 6 a 12 meses, mientras que los SaVs lo fueron entre los niños de 24-30 meses de edad. Estos datos están de acuerdo a lo descrito en la literatura, lo que indica que los SaVs son más frecuentemente detectados en niños de edad más elevada12. Un estándar de estacionalidad para esos tres agentes no puede ser definido porque este estudio abarcó solamente seis meses de vigilancia.

De este modo, los datos obtenidos demuestran la importancia de estos virus en los casos de gastroenteritis aguda tanto en hospitales como en unidades de salud. La detección de SaVs refuerza la necesidad de establecer um sistema de monitoreo para evaluar el impacto de estos virus en otras regiones de Brasil. La caracterización molecular de esos agentes demostró que diferentes genotipos circulan a lo largo del tiempo (o sea, no fueron los mismos en esta investigación y en otras previamente realizadas en Belém). Por lo tanto, estudios moleculares adicionales son necesarios para monitorear esas variaciones. La introducción reciente de vacuna para RV-A en el programa Nacional de Inmunización Pediátrica de Brasil refuerza la necesidad de investigaciones permanentes sobre estas virosis.

 

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos el apoyo técnico prestado por Maria Silvia Sousa de Lucena, Jones Anderson Monteiro Siqueira, Ian Carlos Lima, Dielle Monteiro Teixeira y Jefferson Oliveira, bien como a todo el equipo de campo y a los médicos que trabajaron durante el proyecto "Vigilancia Intensiva de las Diarreas en Hospitales". Este trabajo tuvo el apoyo financiero del IEC/ SVS / MS.

 

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Corresponding / Correspondência / Correspondencia:
Yvone Benchimol Gabbay
Instituto Evandro Chagas, Seção de Virologia
Rodovia BR316, km 7, s/nº, Levilândia
CEP: 67.030-000 Ananindeua, Pará, Brasi
E-mail:yvonegabbay@iec.pa.gov.br

Recebido em / Received / Recibido en: 31/7/2009
Aceito em / Accepted / Aceito en: 19/10/2009