ARTÍCULO ORIGINAL

Actividad antibacteriana in vitro de extractos brutos de especies de Eugenia sp frente a cepas de mollicutes

Camila Simões Benfatti^I; Samuel Mendes de Cordova^I; Alessandro Guedes^II; Michele Debiasi Alberton Magina^II; Caio Mauricio Mendes de Cordova^II

^ICurso de Farmácia, Universidade Regional de Blumenau, Blumenau, Santa Catarina, Brasil
^IIDepartamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Regional de Blumenau, Blumenau, Santa Catarina, Brasil

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Título original: Atividade antibacteriana in vitro de extratos brutos de espécies de Eugenia sp frente a cepas de molicutes. Traducido por: Lota Moncada

RESUMEN

La necesidad de buscar nuevos antimicrobianos y el interés en las especies de mollicutes viene aumentando constantemente, principalmente por el hecho de que los mollicutes son responsables por el desarrollo de varias enfermedades importantes, como es el caso de Mycoplasma arginini, M. hominis y Ureaplasma urealyticum. Estos dos últimos presentan comprometimiento en infecciones del trato urogenital que pueden llevar a la infertilidad y a complicaciones de la gestación. M. arginini es un importante patógeno animal aislado de ovejas, que causa una enfermedad respiratoria grave llamada de "síndrome de la tos", y, eventualmente, zoonosis en el hombre. El género Eugenia pertenece a la familia Myrtaceae, que comprende cerca de 500 especies de plantas con potencial terapéutico. En este trabajo se obtuvieron extractos brutos de las hojas de Eugenia beaurepaireana, E. brasiliensis y E. umbelliflora, que fueron analizados por el método de microdilución en caldo frente a las cepas de mollicutes. Con eso, se determinó la concentración inhibitoria mínima de los extractos de las plantas, siendo de 1,25 mg/mL para E. beaurepaireana, 2,5 mg/mL para E. brasiliensis, y de 5,0 mg/mL para E. umbelliflora contra las tres especies de mollicutes igualmente. Entre los resultados observados, se destaca principalmente la E. beaurepaireana, que presentó un buen potencial antimicrobiano. Debido a las patogenias importantes que estas bacterias causan, y a la creciente resistencia a los antimicrobianos tradicionales utilizados en el tratamiento, es importante la búsqueda de nuevos tipos de antibióticos dentro de la biodiversidad brasileña. Existen pocos estudios sobre las propiedades farmacológicas de las plantas del género Eugenia, y nuestros resultados son los primeros relatos sobre su actividad antimicrobiana frente a especies de mollicutes.

Palabras clave: Mycoplasma; Ureaplasma; Pruebas de Sensibilidad Microbiana; Productos Biológicos.

INTRODUCCIÓN

Los mollicutes, o micoplasmas, hacen parte de la clase Mollicutes, un gran grupo de microorganismos peculiares, responsables por varias enfermedades en los animales, en las plantas y en el hombre, especialmente Enfermedades Sexualmente Transmisibles (ESTs), cuyas más importantes características son la ausencia de pared celular y el genoma reducido³⁷.

La incidencia de DSTs tuvo una declinación en la década de 1980 y al inicio de la década de 1990, reflejando los cambios en el comportamiento sexual como respuesta a la epidemia de infección por el HIV. Pero estas modificaciones no se mantuvieron, y a partir de 1994, se observó la reincidencia de las patologías de transmisión sexual. Embarazo, nacimiento a término y fertilidad son afectados por la presencia de DSTs, y se hace fundamental la investigación de microorganismos como Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Candida sp, Trichomonas vaginalis y los mollicutes²⁶.

Dos especies de mollicutes merecen destaque en las infecciones del trato urogenital: Mycoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum, adquiridas principalmente por contacto sexual. Ambas han sido encontradas tanto en el hombre como en la mujer, en infecciones del trato urogenital inferior.

Ureaplasma urealyticum es responsable por casos de uretritis no gonocócica y vaginosis bacteriana. Está asociado a la fiebre puerperal, a la corioamnionitis y bajo peso al nacer, y al parto prematuro, además de complicaciones en los recién nacidos. U. urealyticum era clásicamente dividido en 14 serotipos, y éstos, agrupados en dos serogrupos. Actualmente, se halla definida una nueva especie, U. parvum, que engloba los serotipos que pertenecían al serogrupo 1²⁰. Mycoplasma hominis es una de las causas de uretritis no gonocócica y vaginosis bacteriana, asociado a la fiebre post aborto y post parto, epididimitis e infertilidad. También es causa no común de bacteriemia, endocarditis, artritis y otras infecciones menos usuales¹⁴.

Varios estudios demostraron que las tasas de colonización por Mycoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum en hombres, variaba de cero a 13% y de 3% a 56%, respectivamente⁶. Datos similares en mujeres demostraron que las tasas de colonización vaginal por M. hominis y U. urealyticum variaban de cero a 31% y de 8,5% a 77,5%, respectivamente, según la edad, raza, experiencia sexual y nivel socioeconómico⁴¹. Los resultados obtenidos por nuestro grupo corroboran estos estudios, demostrando una alta incidencia de infección en nuestra población²⁷.

El M. arginini (MA) es una especie que infecta animales, y ha sido normalmente aislado de ovejas, causando una enfermedad respiratoria llamada "síndrome de tos" en los ovinos. La manifestación está asociada a una tos paroxística severa, causando incluso prolapso rectal. La enfermedad es crónica y persiste por varias semanas en la mayoría de los animales infectados. Existen evidencias de que la persistencia de estos microorganismos en el trato respiratorio y la naturaleza crónica de la enfermedad pueden deberse a la falla del sistema inmune para generar una inmunidad protectora²⁹. Las razones para esta falla son desconocidas, pero se observa una marcada variabilidad de expresión antigénica en los microorganismos aislados de animales enfermos²⁸. Una característica metabólica singular de esta especie de mollicute es la producción de una enzima arginina deiminasa, y la utilización de la arginina como fuente de energía. La arginina deiminasa (ADI) es una enzima que cataliza la hidrólisis de la arginina en dos compuestos: citrulina y amonio. Se expresa fuertemente en microorganismos que utilizan la arginina como fuente de energía no glicolítica⁹. La ADI derivada de Mycoplasma fue relatada como inductora de apoptosis en amplia variedad de células tumorales humanas in vitro, ejerciendo potente actividad antitumoral in vivo¹³. La actividad antiproliferativa o antitumoral de la ADI se debe, probablemente, a la privación de arginina como fuente nutricional de las células, porque la restitución exógena de arginina restaura el crecimiento celular²¹. La arginina también es un precursor de óxido nítrico (NO), un importante mensajero molecular involucrado en la vasodilatación, neurotransmisión y en actividades citotóxicas de las células del sistema inmune. A pesar de que el NO es benéfico y crítico en la función celular, su superproducción por iNOS en los casos de shock endotóxico causa vasodilatación e hipotensión, llevando al óbito⁴⁰.

En los últimos años, ha sido relatado un número creciente de casos de resistencia de los micoplasmas y ureaplasmas a los antibióticos utilizados en el tratamiento^17,19, incluso a los más efectivos³³. De este modo, la identificación de nuevos antimicrobianos a partir de plantas puede constituir una gran contribución en el combate a estas infecciones.

La familia Myrtaceae está compuesta por cerca de 100 géneros, con aproximadamente 3 mil especies, siendo la mayor familia de la orden, con dos centros de dispersión, en las Américas y en Australia, aunque ocurran en todo el mundo. Según Limberger y colaboradores²⁴, la familia está dividida en dos subfamilias: Myrtoideae y Leptospermoideae. Son todas plantas tropicales o subtropicales, pero sólo en Brasil hay cerca de mil especies. Aquí, todos los representantes nativos pertenecen a la subfamilia Myrtoideae, la que está constituida por apenas una tribu, Myrteae, subdividida en tres subtribus: Eugeniinae, Myrciinae y Myrtinae. En Brasil, los géneros más importantes son Psidium (guayabo), Myrciaria (arazá), Martierea (cambuca), Campomanesia (guabiroba), Paivaea (cambuci), Syzigium (clavo de olor) y Eugenia, al cual pertenecen las especies en estudio en este trabajo. En América del Sur, el género Eugenia se distribuye desde Brasil hasta el norte y nordeste de Argentina, Uruguay y Paraguay⁵. Muchas especies del género Eugenia son apreciadas por sus frutos y usadas como alimento¹², como por ejemplo Eugenia uniflora, una de las especies más conocidas del género, llamada popularmente de pitanga⁵.

Algunos trabajos demuestran el potencial terapéutico de especies del género Eugenia, como: efecto hipoglucemiante, antioxidante³⁶ y protector contra la hipertrofia renal causada por la diabetes¹⁵ en ratones tratados con extracto etanólico de la Eugenia jambolana, antitumoral en células HL-60 de taninos aislados a partir de la Eugenia jambos L.⁴², anticonvulsivante en ratones tratados con el aceite esencial de Eugenia caryophyllata³⁵.

La especie Eugenia brasiliensis Lamarck, se conoce popularmente como grumichama, grumichameira, grumichaba, itapoiroti³⁸ y cumbixaba³⁴. En la medicina popular, el uso de la especie en la forma de infusión de las hojas, fue relatado para el tratamiento de la artritis y el reumatismo, y como diurético. Los frutos maduros se usan como alimento y para preparar bebidas fermentadas³⁹. Debido a su alto tenor de taninos, lo que le confiere acción adstringente, las cáscaras eran usadas en la industria del cuero, como tanantes³¹. Eugenia beaurepaireana (Kiaesrkou) Legrand, sinónimos Myrtus beaurepaireana, Pilothecium ternatifolium, se conoce como ingabaú y guamirim-ferro. De la misma manera que Eugenia brasiliensis, Eugenia beaurepaireana posee poquísimos estudios en la literatura. Eugenia umbelliflora Berg., llamada popularmente de baguaçu, guapê y guamirim, nombres dados al árbol y a sus frutos, crece en las matas del Sudeste de Brasil, pero existen pocas referencias en la literatura a respecto de esta planta.

Todos son árboles pequeños o arbustos que crecen en la mata atlántica, desde los Estados del Nordeste hasta Santa Catarina³⁸. Debido a sus frutos, que son comestibles, estos árboles son muchas veces, cultivados. En Santa Catarina se registró la presencia de estas especies en los municipios de Brusque, Ibirama, Itajaí, Joinville y en la región de Florianópolis.

Estudios anteriores ya ha mostrado que especies del género Eugenia presentan actividad antibacteriana, como, por ejemplo, Eugenia caryophyllus, que presentó inhibición del crecimiento de las bacterias Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes³¹. La misma especie inhibe también el crecimiento de Helicobacter pylori, una bacteria responsable por el surgimiento de úlcera gástrica²³. El aceite esencial obtenido de las hojas de Eugenia uniflora demostró fuerte inhibición del crecimiento de cepas de Bacillus cereus³⁰. La actividad antibacteriana de la especie Eugenia umbelliflora también ha sido descrita en la literatura, cuando hojas y frutos de esa especie mostraron prometedora actividad contra microorganismos gram-positivos, como Staphylococcus aureus²⁵. Sin embargo, contra cepas de Mycoplasma sp y Ureaplasma sp no existen relatos de actividad de las especies de este género de plantas. El objetivo de este trabajo es evaluar la actividad antimicrobiana de extractos hidroalcohólicos de estas especies de plantas nativas de la flora brasileña frente a cepas de mollicutes, capaces de infectar al hombre.

MATERIALES Y MÉTODOS

Los microorganismos utilizados fueron cepas de referencia de Ureaplasma urealyticum (ATCC 27618), Mycoplasma arginini (PG18, Instituto Pasteur), y M. hominis (PG21, Instituto Pasteur). La ureaplasma fue inoculada en medio de cultivo U10 y los micoplasmas en Medio Líquido de Arginina (MLA) fueron preparados en laboratorio e incubados a 37^o C ± 1^o C por 48 h en microaerofilia (2-3% de CO₂)⁷.

El material vegetal - partes aéreas de Eugenia brasiliensis, Eugenia beaurepaireana y Eugenia umbelliflora - se colectó en la ciudad de Santo Amaro da Imperatriz (SC) (27^o41'18" S; 48^o46'41" O) y fue identificado por el profesor Daniel Falkenberg del Departamento de Botánica de la Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Las exsicatas de las especies fueron depositadas en el Herbario del Departamento de Botánica de la UFSC bajo los números FLOR - 34675, 34674 y 17890, respectivamente. Las hojas fueron separadas de los ramos y sometidas a secado a 40^o C. en estufa con circulación de aire. Luego del secado, el material fue molido en molino de cuchillas. Los extractos vegetales se obtuvieron por maceración con etanol a 70% durante siete días. Luego del filtrado, los extractos fueron concentrados en evaporador rotatorio al vacío y el procedimiento repetido dos veces¹⁸.

Los extractos se disolvieron en dimetil sulfóxido (DMSO) y fueron analizados usando el método de microdilución en concentraciones que variaron de 5 mg/mL a 0,0391 mg/mL, frente a cepas de mollicutes. Después de solubilizados, los extractos fueron filtrados con filtros Millex (Millipore) de 0,22 µm para esterilización, considerando la gran facilidad de contaminación del medio debido a su riqueza de nutrientes. Inicialmente, fue analizada la actividad antimicrobiana de los extractos de plantas (100 mg) disueltos en 10 mL de DMSO, solvente considerado inerte para el crecimiento de bacterias. Sin embargo, distintamente a los test ya observados que señalan el DMSO como sustancia inerte en las culturas de bacterias como E. coli, Staphilococcus sp, Streptococcus sp y Klebsiela sp⁸, él solo no presenta inhibición de crecimiento sobre los micoplasmas hasta la dilución 1:8, y fue necesario realizar una solución a 10%.

Los análisis de concentración inhibitoria mínima (minimal inhibitory concentration - MIC) fueron realizados por la metodología estandarizada de microdilución en caldo, en microplacas de 96 cavidades⁴. En primer lugar, se realizó una dilución seriada de los extractos de la planta, en donde a 100 µL de medio de cultivo se le adicionaron 100 µL de extracto; de esta solución, 100 µL fueron retirados y homogeneizados con 100 µL de de medio en la cavidad siguiente, y así sucesivamente, obteniéndose una gama de concentración de extracto de planta (inicialmente a 10 mg/mL) diluida a razón 2 (5 mg/mL en la segunda cavidad; 2,5 mg/mL en la tercera cavidad, y así sucesivamente). A esta gama de concentraciones de extractos de plantas, se le agregó 100 µL de un inóculo de cultivo de micoplasma o ureaplasma en fase log de crecimiento, conteniendo 103 microorganismos/mL (determinado por microtitulación). Como control, se hizo una dilución seriada del mismo solvente (DMSO), sin extracto de planta, y una dilución seriada del cultivo del microorganismo, sin el agregado de solvente o de extracto de planta. Por fin, fueron adicionadas, a todas las cavidades, 2 a 3 gotas de vaselina líquida estéril para aislar cada cavidad del medio externo y crear un ambiente de microaerofilia. Los análisis se realizaron una única vez por duplicado, ya que esta metodología está bien estandarizada y descrita en la literatura clásica da micoplasmología.

Las placas se incubaron a 37^o C ± 1^o C por 48 h, y el crecimiento pudo observarse a partir del cambio de color del medio de cultivo, debido a la presencia del indicador rojo de fenol. Las especies del género Ureaplasma degradan urea a amoníaco y alcalinizan el pH del medio, haciendo un cambio de color de amarillo para rojo, indicando el crecimiento. M. arginini y M. hominis promueven la alcalinización del medio en su crecimiento por desaminación de la arginina en amoníaco. Todos los procedimientos fueron realizados de modo estéril en cámara de flujo laminar.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se iniciaron los cultivos de las cepas de referencia de M. arginini, M. hominis y U. urealyticum conservadas a -20^o C en nuestro laboratorio. Una vez que no enturbian el medio de cultivo, por el tamaño reducido de sus células, su crecimiento queda evidenciado por la formación de amoníaco a partir de la desaminación de la arginina o de la urea, alcalinizando el pH del medio, cambiando la coloración del indicador rojo de fenol presente en la formulación, de amarillo para rojo en la franja de pH de 6,6 a 8,0 (Figura 1).

En los test de microdilución realizados frente a la cepa de M. arginini, apenas E. beaurepaireana y E. brasiliensis presentaron actividad antimicrobiana al menos hasta la concentración de 2,5 mg/mL, E. umbelliflora presentó actividad solamente hasta la concentración 5,0 mg/mL (Tabla 1).

En los test realizados frente a la cepa de U. urealyticum, apenas E. beaurepaireana presentó actividad antimicrobiana hasta la concentración 1,25 mg/mL, E. brasiliensis presentó actividad hasta 2,5 mg/mL y E. umbelliflora presentó actividad solamente hasta la concentración 5,0 mg/mL (Tabla 1).

La misma actividad antimicrobiana fue observada frente a la Mycoplasma hominis, con un MIC de 1,25 mg/mL para E. beaurepaireana, 2,5 mg/mL para E. brasiliensis, y 5,0 mg/mL para E. umbelliflora (Tabla 1).

Como se puede observar, el DMSO ejerce cierto efecto tóxico sobre el crecimiento de mollicutes, al contrario de lo que sucede con especies de bacterias típicas, como Pseudomonas sp, E. coli, y Staphylococcus sp⁸. Este hecho, probablemente, se debe a la característica de los mollicutes de ser desprovistos de pared celular, lo que los vuelve más sensibles a alteraciones osmóticas y a otras agresiones a la membrana celular. Esta es una característica peculiar de esta clase, semejándose, en este sentido, a las células de los microorganismos eucarióticos.

Entretanto, fue posible verificar que todos los extractos de las plantas Eugenia beaurepaireana, Eugenia brasiliensis y Eugenia umbelliflora poseen actividad antimicrobiana, aunque aparentemente pequeña, contra las cepas de los mollicutes estudiados. Las dificultades en el cultivo de estos microorganismos explican, en parte, la escasez de publicaciones, tanto internacionales como nacionales, relacionadas a la evaluación de la actividad antimicrobiana de productos naturales contra especies de mollicutes.

Se debe destacar que los test fueron realizados con los extractos brutos de las hojas de las plantas, solubles en DMSO a 10% en agua. Seguramente, compuestos aislados deben presentar una actividad antimicrobiana todavía mayor. Trabajos adicionales de nuestro grupo buscarán realizar estudios con subfracciones y compuestos aislados de las plantas para la investigación de nuevos antimicrobianos con potencial terapéutico.

Con relación a la Eugenia brasiliensis, se registran en la literatura pocos relatos sobre compuestos químicos y actividades farmacológicas. Ha sido realizado un estudio de los componentes del aceite esencial de dos ejemplares de esta especie, colectados en el estado de São Paulo. Los compuestos encontrados mayoritariamente fueron α-selineno (17,3% y 12,6 %) y β-selineno (13,3% y 14,8 %), β-cariofileno (8,7% y 12,6 %) y α-pineno (0,7% y 6,6 %)¹². De la misma manera, raros estudios en la literatura presentan las propiedades farmacológicas de Eugenia beaurepaireana apresentam raros estudos na literatura. Apenas un relato fue encontrado a respecto del estudio del aceite esencial. Los compuestos mayoritarios presentes en el aceite esencial de esta especie son el biciclo germacreno (14,3%), Δ-cadineno (7,2%), T-cadinol (6,5%), α-cadinol (6,1%) y β-cariofileno (6,4%)2. De los frutos de Eugenia umbelliflora se relata la presencia de antocianinas²². El aceite esencial también se estudió, mostrando un alto de tenor de α-pineno (24,7%) y β-pineno (23,5%)¹. Existen poquísimas referencias en la literatura a respecto de esta planta.

CONSIDERACIONES FINALES

Nuestros hallazgos a respecto de la actividad de los extractos brutos de estas plantas, nativas de la mata atlántica brasileña, contra especies de ureaplasma y micoplasmas son importantes, ya que pueden constituir nuevas fronteras en las áreas de la micoplasmología y productos naturales de interés terapéutico. Como discutimos, cepas de Mycoplasma hominis resistentes a la tetraciclina, azitromicina, clindamicina y varias fluoroquinolonas han sido relatadas cada vez con mayor frecuencia^33,10,3,16. Así mismo, la resistencia de Ureaplasma sp a las drogas utilizadas para su tratamiento, aumenta constantemente^10,32,11. El aislamiento y el estudio de los compuestos de estas plantas con actividad antimicrobiana tiene gran potencial para el desarrollo de nuevos fármacos.

AGRADECIMIENTOS

Al Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica (PIBIC) del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) por el apoyo financiero a los becarios S. M. de C. y C. B. durante la realización de este proyecto.

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Correspondência / Correspondence / Correspondencia:
Caio Mauricio Mendes de Cordova
Departamento de Ciências Farmacêuticas,
Universidade Regional de Blumenau, Campus III
Rua São Paulo, 2171,
Itoupava Seca Blumenau-Santa Catarina-Brasil 89030-000
E-mail:cmcordova@furb.br

Recebido em / Received / Recibido en: 3/6/2009
Aceito em / Accepted / Aceito en: 25/9/2009