ARTÍCULO ORIGINAL

Desarrollo de PCR multiplex para detección y diferenciación de categorías de Escherichia coli diarreogénicos

Ana Roberta Fusco da Costa^I; Karla Valéria Batista Lima^II; Cintya Oliveira de Sousa^III; Edvaldo Carlos Brito Loureiro^III

^ILaboratório de Biologia Molecular, Seção de Bacteriologia e Micologia, Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil
^IILaboratório de Biologia Molecular, Seção de Bacteriologia e Micologia, Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil. Centro de Ciências Sociais e Educação, Universidade do Estado do Pará, Belém, Pará, Brasil
^IIILaboratório de Enteroinfecções Bacterianas, Seção de Bacteriologia e Micologia, Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil

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Título original: Desenvolvimento de PCR multiplex para detecção e diferenciação de categorias de Escherichia coli diarreiogênicas. Traducido por: Lota Moncada

RESUMEN

INTRODUCCIÓN: Las Escherichia coli diarreogénicas (DEC) son consideradas una importante causa de diarrea en los países en desarrollo. Para su correcta identificación, esos microorganismos deben ser diferenciados de los miembros no patogénicos de la microbiota intestinal. Las DEC pueden clasificarse en seis categorías, de acuerdo a su mecanismo de patogenicidad.
MATERIALES Y MÉTODOS: Se desarrollaron y evaluaron dos sistemas de PCR multiplex para la detección de E. coli enteropatogénicas (EPEC), enterotoxigénica (ETEC), enteroinvasora (EIEC) y productora de toxina Shiga (STEC).
RESULTADOS: Cuatro categorías diarreogénicas fueron detectadas entre los aislados de E. coli obtenidos de individuos infectados por HIV, con EIEC y EPEC representando los patotipos más frecuentes. Dos STEC stx1 y eae positivas fueron identificadas, siendo este el primer relato de aislamiento de esa categoría en individuos infectados por HIV en el estado de Pará. La PCR multiplex se mostró como técnica eficiente, rápida y reproductible para la detección de los aislados de DEC. Los dos sistemas de PCR multiplex presentaron resultados 100% concordantes a los encontrados en la PCR simple.
CONCLUSIÓN: Debido a su simplicidad, economía y eficiencia, se hace posible la aplicación de los protocolos multiplex para agilizar el diagnóstico molecular de las categorías de DEC, lo que promoverá la elaboración de nuevos proyectos de investigación y dará apoyo a las actividades de vigilancia epidemiológica desarrollados por los institutos de salud pública.

Palabras clave: Reacción en Cadena de la Polimerasa; Escherichia coli; Factores de Virulencia; Enfermedades Intestinales.

INTRODUCCIÓN

Las Escherichia coli diarreogénicas (diarrheagenic E. coli - DEC) representan importante causa de diarrea endémica y epidémica en el mundo²⁹. Sin embargo, es probable que la frecuencia de esos patógenos sea subestimada, debido a que su detección exige métodos diagnósticos específicos que no se utilizan en la práctica clínica.

La identificación de E. coli diarreogénica requiere su diferenciación de las especies no patogénicas de la microbiota intestinal⁴³. Las E. coli que causan diarrea se clasifican en categorías patogénicas de acuerdo a factores de virulencia específicos, codificados por cromosomas, plásmidos y DNA de bacteriófagos. Esos factores de virulencia suministran a cada categoría una capacidad de causar síndrome clínica con características epidemiológicas y patológicas distintas³⁸.

De acuerdo a sus mecanismos de patogenicidad las DEC pueden ser clasificadas en: E. coli enteropatogénica (EPEC); E. coli enterotoxigénica (ETEC); E. coli enteroinvasora (EIEC); E. coli productora de toxina de Shiga (STEC); E. coli enteroagregativa (EAEC) y E. coli difusamente adherente (DAEC)^29,42,48. Esas categorías pueden ser eventualmente identificadas a través de ensayos serotípicos, fenotípicos y moleculares²⁹. El primero requiere la identificación de antígenos somáticos (O) y flagelares (H). En la rutina de laboratorio, se realiza apenas la investigación de los serogrupos por determinación de los antígenos somáticos. Esto, sin embargo, no es suficiente para identificar una muestra como diarreogénica, debido a no estar correlacionado, en algunos casos, con la presencia de factores de virulencia²⁴. Por lo tanto, la identificación debe ser dirigida a las características que determinan la virulencia de esos microorganismos.

Los ensayos fenotípicos para la detección de toxinas, patrón de adherencia o invasión pueden identificar muestras de E. coli diarreogénicas, pero requieren, sin embargo, elevadas inversiones, técnicas especiales y aplicación de varios sistemas de detección (ej.: cultura de células, ensayos de citotoxidad), además de consumo de largos períodos^2,25. Con la aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction - PCR) es posible detectar genes involucrados con la patogenicidad de diversos aislados bacterianos, permitiendo simple identificación³⁴.

En la investigación de patógenos la PCR es indicada para la amplificación de una región específica del DNA que permite la detección de determinado locus de virulencia. Técnicas de PCR convencionales para la investigación de E. coli diarreogénicas han sido relatadas, pero, la investigación de los aislados bacterianos requiere un gran número de reacciones individuales para la detección de varios factores de virulencia, lo que la vuelve laboriosa²⁰.

Para reducir el número de test necesarios para la identificación de DEC, han sido desarrollados varios sistemas de PCR de detección múltiple (multiplex) para la amplificación simultánea de dos o más loci en una única reacción^25,27,50. No obstante, usualmente se requiere más de una PCR multiplex⁴³. Para simplificar y disminuir el tiempo para el diagnóstico diferencial, en este estudio fueron desarrollados sistemas de PCR multiplex aplicados para identificación de las siguientes categorías de DEC, cuyos marcadores de virulencia ya están bien definidos: ETEC, EPEC, EIEC y STEC.

MATERIALES Y MÉTODOS

AISLADOS BACTERIANOS

Este estudio incluyó 720 E. coli almacenadas en la bacterioteca de la Sección de Bacteriología y Micología del Instituto Evandro Chagas (IEC), caracterizadas por métodos fenotípicos tradicionales como descrito previamente⁵. Las E. coli fueron aisladas de muestras fecales de 181 individuos mayores de 18 años infectados por el HIV, durante los años de 2000 a 2002.

El proyecto que dio origen a este trabajo fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación con Seres Humanos del IEC bajo parecer n^o 02/2000 en 26 de mayo de 2000.

PCR

Para la investigación de los factores de virulencia, las muestras fueron repicadas para tubos de ensayo con agar TSI (Difco), incubadas a 37^o C por 24 h y posteriormente repicadas para tubos con agar TSA (Difco) para extracción del DNA. Para la extracción del ADN bacteriano se utilizó la técnica de termo extracción, y el crecimiento bacteriano fue transferido para microtubos con 400 µL de agua purificada esterilizada y sometido a 100^o C por 10 min. Luego del hervido, la suspensión se congeló a -20^o C. Después de esa etapa, la suspensión fue descongelada y centrifugada a 13.000 rpm (16845xg) en microcentrífuga (mod. NT-805, Nova Técnica).

Las categorías diarreogénicas EPEC, ETEC, EIEC y STEC fueron investigadas por medio de realización de PCR simple para siete diferentes marcadores moleculares, de acuerdo con condiciones establecidas en estudios anteriores (Cuadro 1).

Las E. coli diarreogénicas fueron clasificadas según la presencia de genes de factores de virulencia, de acuerdo a criterios previamente publicados (Cuadro 2)⁷.

Cada reacción presentó volumen final de 50 µL conteniendo 1 mM de deoxinucleótidos (Invitrogen), 10 pmol de cada oligonucleótido (Invitrogen), 1,5 mM de MgCl₂ (Invitrogen), tampón de Taq ADN polimerasa 1x (Invitrogen), 0,25 U de Taq ADN polimerasa (Invitrogen), y 3 µl de ADN. Las condiciones de amplificación comprendieron denaturación inicial a 94^o C por 5 min, 35 ciclos con 1,5 min a 94^o C, 1,5 min a 50/56^o C y 1,5 min a 72^o C y extensión final por 10 min a 72^o C. Las reacciones fueron realizadas en termociclador (mod. CE 3832, Thermo Hyband). Los productos de PCR fueron separados por electroforesis en gel de agarosa D-1 LE GQT a 2% (BioAmerica) conteniendo 1 µg/mL de bromuro de etideo (Sigma) y visualizados en transiluminador UVP (BioImaging Systems).

Para desarrollar los ensayos de PCR multiplex se probaron varias temperaturas de anillamiento, concentraciones de reactivos e incorporación progresiva de los oligonucleótidos. La sensibilidad y la especificidad de la reacción fueron ensayadas con las cepas de referencias E2348/69 (EPEC), H10407 (ETEC LT-I/STa), EDL1284 (EIEC) y EDL933 (STEC). La cepa de E. coli K12 se usó como control negativo. Los oligonucleótidos utilizados están descritos en el cuadro 1.

RESULTADOS

Para identificación simultánea y diferenciación cuatro categorías diarreogénicas de E. coli desarrollaron dos sistemas de PCR multiplex (Sistemas 1 y 2) conteniendo, respectivamente, tres y cuatro pares de iniciadores (Cuadro 3).

Cuando los pares de oligonucleótidos fueron incorporados en los sistemas multiplex, se observó una interferencia. Este fue el caso de LT-1/LT-2 que a la concentración de 10 pmol/µL inhibió la amplificación de eae. En esta situación, la modificación de la concentración de LT-1/LT-2 para 5 pmol/µL fue suficiente para favorecer la amplificación del blanco esperado (eae).

Apenas los loci meta fueron detectados en los controles positivos, sin que aparecieran amplificaciones inespecíficas. Como control positivo de los sistemas de PCR multiplex se utilizó una mezcla conteniendo el ADN de las cepas de referencia, observándose reproductibilidad con los resultados obtenidos en la PCR simple. Las amplificaciones visualizadas en los sistemas 1 y 2 de PCR multiplex están demostradas en la figura 1.

La especificidad de los productos obtenidos reacciones de PCR multiplex fue determinada estudio de las muestras de referencia. Para validar los sistemas de PCR multiplex desarrollados y para la demostración de la utilidad diagnóstica, se analizaron los 78 aislados caracterizados por PCR simple como DEC y el triple de muestras (234 aislados) con resultados de PCR negativos, comprendiendo el total de 312 test.

Entre las 720 E. coli testeadas por PCR simple 78 (10,8%) presentaron un o más genes característicos de DEC, siendo identificadas en: EIEC (n = 34), EPEC (n = 29), ETEC (n = 13) y STEC (n = 2). De las 29 EPEC encontradas 28 fueron clasificadas como EPEC atípicas, por la ausencia del gen bfpA (fimbria BFP). Las 13 ETEC fueron caracterizadas como LT-I (n = 2) y STa (n = 11). Un total de 34 aislados pertenecía a la categoría EIEC. Se identificaron dos STEC, siendo stx1 y eae positivas. En el análisis comparativo de los datos obtenidos se encontró concordancia de 100% entre los resultados de PCR simple y multiplex.

DISCUSIÓN

Algunas DEC son genéticamente diferenciadas de las demás por la presencia de genes codificantes de factores de virulencia específicos que han sido utilizados en la identificación^6,7,29,35,39. Entre ésos, ha sido ejecutada la detección simultánea de múltiples genes de virulencia por medio de ensayos de PCR multiplex^4,36,41. Para reducir el número de PCR realizadas, nosotros desarrollamos dos sistemas de PCR multiplex para detección de siete genes de factores de virulencia, característicos de cuatro patotipos: EPEC, ETEC, EIEC y STEC. Aunque sean conocidas seis linajes de E. coli diarreogénicas, solamente esas cuatro presentaron marcadores de virulencia bien definidos²⁹.

Algunos estudios han sugerido blancos moleculares para caracterización de EAEC, como los genes setBA, aaiA, astA y aat. No obstante, se ha observado que algunos de estos marcadores no son exclusivos de esa categoría^17,19. Los genes afa, dra y daa, codificadores de una familia de adhesinas, han sido utilizados para la caracterización de DAEC, pero, los mismos pueden estar presentes en E. coli no patogénicas²². Por tanto, debido a esas peculiaridades, se recomienda la inclusión de ensayos de adherencias en cultivo de células HEp-2 o HeLa como método estándar de oro para definición de las categorías EAEC y DAEC²⁹.

Son crecientes las descripciones de sistemas de PCR para identificación simultánea de múltiples loci. Pass et al³³ realizaron PCR multiplex para detección de 11 diferentes factores de virulencia, sin embargo, utilizaron cuatro sistemas, lo que representa poca practicidad. Nguyen et al³¹ presentaron un ensayo de PCR-Multiplex para detección de ocho genes característicos de EPEC, ETEC, EIEC, STEC y EAEC, pero de baja capacidad resolutiva entre ETEC-LT y EIEC (diferencias de 2 pb entre los fragmentos característicos de esas categorías). Müller et al²⁸ también desarrollaron un sistema de PCR multiplex para identificación de DEC, apenas aplicado, sin embargo, a las categorías EPEC y EIEC.

Otros estudios han relatado el uso de PCR multiplex para identificación de varios patotipos^{6,20,30,43,48}. Sin embargo, presentan como limitación la inhabilidad de diferenciar todas las categorías de DEC, principalmente en infecciones mixtas por EPEC atípicas y STEC, tornando necesaria la realización de otras PCR para verificar los resultados.

En este estudio se desarrollaron dos sistemas de PCR multiplex de rápida optimización, ejecución simple, fácil implantación en la rutina de los laboratorios de referencia, baratos - cuando comparados a los sistemas de PCR que utilizan marcadores fluorescentes - y que dispensan la realización de PCR adicionales para esclarecimiento de los resultados, como por ejemplo, en presencia de patotipos que compartan marcadores de virulencia. El método permitió la identificación de cuatro categorías diarreogénicas, representando un 10,8% de los aislados, con predominio de EIEC seguido de EPEC, con mayor prevalencia de la subcategoría atípica.

Las EIEC son capaces de invadir la mucosa intestinal causando ocasionalmente cuadro de disentería. Estudios relatan la muy baja incidencia para esa categoría, siendo la mayor ocurrencia relacionada a brotes y entre niños de países en desarrollo^{13,14,15,23,26}. Investigaciones realizadas en Brasil sobre enteropatógenos involucrados en diarrea infantil demostraron baja frecuencia de EIEC^11,37, contrastando con los hallazgos de este estudio. Sin embargo, tal diferencia puede estar asociada a la franja etaria y a la población analizada, siendo que en aquellos estudios fueron investigados niños y, en el presente trabajo, se evaluaron aislados provenientes de individuos adultos infectados por HIV. En estudio con individuos por HIV en Senegal, el patotipo EIEC representó la segunda categoría de E. coli más prevalente¹², semejante al encontrado en este trabajo.

De los 29 aislados de EPEC, 28 fueron clasificados como EPEC atípicas. La división de muestras de EPEC en típicas y atípicas tiene importante implicación clínico-epidemiológica, antes no valorizada. Por muchos años, algunos serotipos de EPEC típicas asociados a la diarrea infantil fueron aislados con frecuencia, pero ha sido observada la reducción de esta subcategoría y un aumento relativo del aislamiento de EPEC atípicas en muchos países^{1,18,21,40,45,46,49}. Algunos trabajos sugieren que las EPEC atípicas sean tan patogénicas como las típicas, aunque haya sido relatado que la diarrea provocada por esa subcategoría sea más suave⁵¹. Hay registros también de que las EPEC atípicas estén más significativamente asociadas a la diarrea endémica o como causa de brotes^9,10,51.

Dos STEC stxl y eae positivas fueron identificadas. Las infecciones debido a STEC son relatadas en casos esporádicos en Brasil^3,6,11,16, siendo este el primer relato de aislamiento de esa categoría en individuos infectados por HIV en el Estado de Pará.

CONCLUSIÓN

Los resultados de este estudio demostraron la diversidad de patotipos de E. coli aislados de individuos infectados por HIV, con predominio de EIEC y EPEC atípicas. Los sistemas de PCR-Multiplex se mostraron como una metodología simple, económica y eficiente para una rápida selección e identificación de aislados de DEC, y, de esta manera, pueden ser incorporados a la rutina de laboratorios de referencia, dando apoyo a las actividades de vigilancia epidemiológica desarrolladas por los institutos de salud pública.

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Correspondência / Correspondence / Correspondencia:
Ana Roberta Fusco da Costa
Laboratório de Biologia Molecular, Seção de Bacteriologia e Micologia
Instituto Evandro Chagas
BR 316, km 7, 67030-000 Ananindeua-Pará-Brasil
Telefone: 55 91 3214-2116 / Fax: 91 3214-2114
E-mail: anacosta@iec.pa.gov.br / robertafusco@gmail.com

Recebido em / Received / Recibido en: 31/7/200
Aceito em / Accepted / Aceito en: 22/9/2010