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Revista Pan-Amazônica de Saúde

versão impressa ISSN 2176-6223versão On-line ISSN 2176-6223

Rev Pan-Amaz Saude v.1 n.3 Ananindeua set. 2010

http://dx.doi.org/10.5123/S2176-62232010000300007 

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Ocurrencia de adenovirus en niños con gastroenteritis aguda grave en la Ciudad de Belém, Estado de Pará, Brasil

 

 

Elza Caroline Alves Muller; Maria Aline Aguiarde Morais; Yvone Benchimol Gabbay; Alexandre da Costa Linhares

Seção de Virologia, Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil

Endereço para correspondência
Correspondence
Dirección para correspondencia

 

Título original: Ocorrência de adenovirus em crianças com gastrenterite aguda grave na Cidade de Belém, Pará, Brasil. Traducido por: Lota Moncada

 

 


RESUMEN

Las gastroenteritis son una de las principales causas de enfermedad infantil en todo el mundo. Estudios epidemiológicos detectaron adenovirus en 2% a 22% de los casos de diarrea aguda infantil en hospitales y dispensarios clínicos. Los adenovirus son responsables por 50% de los casos de intususcepción intestinal pediátrica. El objetivo del estudio fue detectar la presencia de estos virus en las muestras fecales de 380 niños menores de 3 años de edad, con cuadro de gastroenteritis, en la Ciudad de Belém, Estado de Pará, Brasil. con énfasis en el serotipo 40/41. Las muestras eran provenientes de un estudio de vigilancia hospitalaria y ambulatoria, realizado por el Instituto Evandro Chagas en el período de marzo a setiembre de 2003. Se usaron las técnicas de ElAe inmunocromatografía para la selección, y cultivo de células y PCR para tipado. Los adenovirus fueron encontrados en 6,3% (24/380) de las muestras. Ya el adenovirus entérico estaba presente en 3,7% (14/380) de las muestras analizadas, lo que equivale a 58,3% (14/24) de los casos positivos, lo que demostró que ese virus es causa de gran parte de los casos de gastroenteritis en niños. La técnica más sensible fue la de PCR, que fue capaz de definir serotipos de cinco muestras que estaban sin definición. Los adenovirus entéricos predominaron en la franja etaria de 18-24 meses y el mayor número de casos ocurrió en el mes de marzo de 2003, con tiempo de hospitalización de mayor frecuencia en torno a seis días. Los resultados obtenidos en este estudio confirman la circulación de ese virus en la Ciudad de Belém, demostrando su importancia como causa de gastroenteritis en niños.

Palabras clave: Gastroenteritis; Adenovirus Humanos; Reacción en Cadena de la Polimerasa.


 

 

INTRODUCCIÓN

Las gastroenteritis agudas se constituyen un problema de impacto mundial en términos de salud pública. Esto es especialmente grave en los países en desarrollo, en donde las enfermedades diarreicas representan un factor muy importante de mortalidad infantil, alcanzando, principalmente, a menores de 5 años de edad1,2,3.

Datos demográficos señalan que la tasa de mortalidad infantil en Belém, el año 2000, era de 27,2 para cada mil nacidos vivos, siendo que gran parte de esos óbitos ocurrió por enfermedad diarreica, principalmente entre los menores de 1 año de edad4.

Los adenovirus entéricos (AdEs) integran la familia Adenoviridae, género Mastadenovirus, subgénero F, que comprenden los serotipos 40 y 41. Se admite que el mecanismo básico de transmisión de esos agentes virales suceda de persona a persona, vía fecal-oral, instalándose en células epiteliales del trato gastrointestinal, considerándose además que el trato respiratorio se puede constituir en fuente de infección5,6.

Las gastroenteritis causadas por AdEs, presentan evolución de 5 a 12 días, ocurriendo diarrea acuosa, vómitos, hipertermia moderada y deshidratación leve. Son de gravedad moderada, aunque ya haya sido relatado un caso de óbito7. También pueden aparecer manifestaciones respiratorias. Los AdEs acometen a individuos menores de 2 años de edad8. En adultos, las infecciones por adenovirus tienen carácter esporádico, siendo responsables por cerca de 1% a 3% de los casos de enfermedad respiratoria alta. Esta situación se altera cuando los individuos están alojados en habitaciones colectivas (cuarteles, internados, etc.) La infección asume, así, carácter epidémico9. Uno de los factores relevantes para el estudio de los adenovirus, se refiere al hecho de que son los causantes de 50% de los casos de intususcepción intestinal pediátrica, produciendo hipertrofia de las placas de Peyer, lo que actuaría como punto de partida para la obstrucción, y consecuentemente, la intususcepción10 (Figura 1).

 

 

En un estudio realizado en la Ciudad de São Luis, Estado de Maranhão, con 245 muestras diarreicas y no diarreicas, se obtuvo un total de 21 casos positivos para adenovirus (8,6%). Los AdEs se detectaron en un 3,3% de las muestras (8/243) y los adenovirus no entéricos (AdNE) estaban presentes en un 5,3% de las muestras (13/245)11.

En todo el mundo ya se reconoce la importancia del rotavirus entre las gastroenteritis infantiles. Sin embargo, todavía hace falta más estudios a respecto de los adenovirus entre las causas de la diarrea aguda en niños.

En presente trabajo, por lo tanto, tiene como objetivo detectar la presencia de adenovirus en heces provenientes de 380 niños diarreicos, que participaron de un estudio de vigilancia hospitalaria en Belém, Estado de Pará; obtener datos a respecto de la circulación de ese virus en nuestra ciudad, y con eso, alertar a la población, particularmente a investigadores y médicos, sobre la importancia de ese virus.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

TÉCNICAS EMPLEADAS

El grupo estudiado abarcó a 380 niños que participaron de un estudio de vigilancia hospitalaria/ ambulatorio, en el período de marzo a setiembre del 2003. Todos estos niños tenía un cuadro de gastroenteritis moderada a grave, y las muestras fecales fueron colectadas en nivel ambulatorio y hospitalario.

Inicialmente, las suspensiones fecales a 8% se analizaron por la técnica de EIA, utilizando el método Premier Adenoclone (Meridian Bioscience, Ohio, EUA). El método contenía una microplaca de poliestireno con varios orificios sensibil izados con anticuerpos monoclonales específicos dirigidos contra los antígenos hexon reactivos de grupos, por lo tanto, compartidos por todos los adenovirus humanos, caninos, porcinos y bovinos, entre otros12.

Todas las muestras positivas obtenidas por EIA fueron serotipadas para adenovirus entérico por medio del kit Premier Adenoclone® Type 40/4, proveniente del laboratorio Meridian Bioscience (Ohio, EUA). Esta técnica tiene el mismo fundamento del EIA global, pero se destina a detectar, tan solo, los antígenos específicos de la porción hexon AdE 40/41, con metodología similar a la del anterior.

En un segundo momento, se analizaron 286 muestras por la técnica de inmunocromatográfica. Para este ensayo se utilizó el kit Adeno-Strip, del laboratorio Coris BioConcept (Gemblux, Bélgica). Este test consiste en la utilización de tiras reactivas con una membrana de nitrocelulosa, la que posee partículas coloidales y específicas del anticuerpo monoclonal del ratón, dirigidas contra los antígenos hexon de los grupos A y F de los adenovirus, y un antisuero polivalente de cabra anti-IgG de ratón13.

Os espécimes positivos pelo EIA e pelo ensaio imunocromatográfico foram tipados por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR). A extração do DNA viral foi feita utilizando-se o kit QIAamp® DNA Stool Mini kit (50), fabricado pelo laboratório QIAGEN Inc (Valencia, EUA).

Para la reacción de PCR especie-específica se utilizaron iniciadores (primers) consensuales, descritos en el tabla 114.

 

 

El producto de amplificación de la PCR fue analizado por electroforesis horizontal (120 voltios por 35 min) en gel de agarosa a 1%, utilizando tampón TBE 0,5X pH 8,4. Luego de la electroforesis, el gel fue teñido en solución de bromuro de etidio a 0,5 |ig/mL durante 30 min. La visualización de los amplicons se efectuó en transiluminador de ultravioleta y se fotografió en sistema de captura de imagen. Se utilizó como estándar de peso molecular el "ADN Ladder" de 123 pares de base (pb).

Todas las muestras de adenovirus no entérico (AdNE) se encaminaron para la vía clásica de identificación viral, o sea, la inoculación en células HEp-215. Se realizó la inoculación de 0.2 mL de la muestra de suspensión fecal en la proporción de 1:8, con AdNEs, en tubos de poliestireno con células HEp-2 en monolayer, mantenidas con 1 mL (en cada tubo) de Medio Mínimo de Mantenimiento, el que contenía solución de sales balanceadas (BSS), bicarbonato de sodio, sales de "Hanks", L-glutamina, aminoácidos no esenciales y esenciales, vitaminas, coenzimas, hormonas, ácidos nucleicos y derivados y 5% de suero bovino fetal.

Las células fueron mantenidas a 37o C en atmósfera húmeda y fueron observadas diariamente en microscopio óptico invertido, para visualizar el efecto citopatogénico (ECP). Como control negativo se utilizaron tubos no inoculados de HEp-2 del mismo pasaje (Figura 2).

 

 

La identificación de los tipos de adenovirus no entéricos (Ad1 a Ad8) se realizó por medio de seroneutralización. Se utilizaron dos tubos de cultivo de HEp-2 para cada tipo viral y una mezcla conteniendo 0,25 mL de antisueros tipo específicos adicionados al mismo volumen de la "dosis-desafío" (dosis Challenge), obtenida por ocasión de la titulación. Los tubos se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente y, luego, se inoculó 0,2 mL por tubo. La identificación viral fue posible, observando la ausencia de efecto citopatogénico debido a la neutralización del antígeno por el anticuerpo, demostrando ser el tipo específico.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los adenovirus se detectaron en 6,3% (24/380) de las muestras analizadas por EIA y/o inmunocromatografía, y entre éstas, los AdEs correspondieron a un 3,7% (13/380) del total, una parte expresiva, por lo tanto, de las muestras analizadas. Los adenovirus se detectaron en 7% (18/257) de los especímenes analizados por EIA y en 7,3% (20/286) por inmunocromatografía. Entre la muestras analizadas por ambas técnicas, los adenovirus fueron encontrados en un 9,1% (15/164) de los casos.

Los test de ELISA e inmunocromatografía específica para la detección de adenovirus entérico (40/41) fueron realizados en las 24 muestras positivas obtenidas por ambas técnicas, siendo que 12 reaccionaron para AdE por EIA, diez por inmunocromatografía y 14 por PCR (Figura 3).

 

 

Estudios realizados en otras localidades presentaron un porcentaje de AdE menor que el encontrado en esta investigación: Rio de Janeiro, Niterói, Londrina y Juiz de Fora indicaron una positividad de 1,55%16. Esos virus también fueron detectados en porcentajes comparativamente más elevados en China (9,6%), en Irán (6,7%) y en Alemania (14%), abarcando niños diarreicos hospitalizados17,18,19, así como en un estudio realizado en el noroeste de Nigeria, que registró una positividad del 23% con relación a la presencia de adenovirus20. Vale destacar que las diferencias observadas entre los estudios se deben al hecho de que, las muestras de nuestro estudio fueron provenientes de niños con cuadro de gastroenteritis moderada a grave; por lo que se anticipaban tasas más elevadas de positividad para los AdEs.

Los adenovirus no entéricos estaban presentes en 2,6% (10/380) de las muestras, con equivalencia del 41,6% (10/24) a las positivas. Entre las muestras negativas para AdE que fueron inoculadas en cultivo de células, en 5 de ellas no se observaron alteraciones morfológicas específicas que sugirieran la replicación de adenovirus. En las otras cinco muestras no se verificó el efecto citopatogénico. Estas muestras fueron tituladas y la seroneutralización señaló que tres eran adenovirus de tipo 2; las demás no fueron neutralizadas por ninguno de los antisueros utilizados (1 a 8) debido a la posible presencia de otro tipo de adenovirus, o aún, a un agente viral difuso. Los especímenes provenientes de este estudio fueron previamente analizados con relación a la presencia de rotavirus. Analizando los resultados obtenidos, se observó la presencia de tres casos de infección mixta involucrando rotavirus y adenovirus.

El test de PCR fue realizado en 24 muestras utilizándose los primers A (serotipos 12, 18 y 31), B (3, 7, 11, 14, 21, 34, 35 y 50), C (1, 2, 5 y 6), D (8, 9, 10, 13, 15) E (4) y F (40 y 41). Los resultados indicaron 14 muestras positivas para el primer F (3,7% - 14/380), cinco positivas para el primer C (1% - 4/380), una para el D y una para el E. Una muestra se mostró positiva para los primers C y F, sugiriendo coinfección por AdE y AdNE, respectivamente. Un total de cuatro muestras no fue tipada por ninguno de los primers analizados (Figura 4).

 

 

Los datos obtenidos por PCR son similares a los de otro estudio realizado en los estados de Rio de Janeiro y Bahia, con 3.060 muestras de niños hospitalizados con síntomas de gastroenteritis, en el cual se obtuvo un 2% de las muestras positivas por PCR; de ellas, un 65% fueron positivas frente al primer F. Varios casos de coinfección fueron detectados, entre estos el F/C, que también fue observado en nuestro estudio21.

Se observaron frecuencias de positividad comparables entre niños de sexo masculino 6,4 % (13/203) y femenino 5,3% (9/169). En dos de las muestras no se pusieron a disposición datos sobre el sexo de los niños.

Con relación a la distribución por franja etaria, se observó un porcentaje mayor de positivad para la franja entre 18-24 meses para los adenovirus en general, correspondiendo a 5% (3/60) de casos positivos para los AdEs y 6,6% (4/60) para los AdNes, del total de niños en esta franja de edad (Tabla 2). La mayor frecuencia en esta franja etaria también se registró en otros estudios, comprendiendo a niños menores a cuatro años. En un estudio realizado en el Estado de Maranhão, abarcando a niños de hasta 5 años de edad, la franja etaria más acometida por el AdE fue la de 12-18 meses, con un porcentaje de 14,3%22. Tal diferencia puede ser justificada por la diferencia de franja etaria, considerando el estudio en Belém.

 

 

Con relación a la distribución temporal de los AdEs, el período de mayor porcentaje fue en marzo, con 10% (2/20) de los casos positivos, seguidos por los meses de junio, con 6,6% (4/60), mayo, con 3,38% (2/59), agosto, con 3,33% (2/60) y abril, con 1,75% (1/57). Con referencia a los AdNEs, se observó mayor prevalencia en agosto, con 7% (4/60), siguiendo los meses de abril, con 5,26% (3/57), mayo, con 3,38% (2/59) y julio, con 3% (2/65). Este discreto aumento de AdE en marzo, puede ser asociado, tal vez, al mayor índice de precipitación pluviométrica en la región. Cabe destacar, sin embargo, que no hay evidencia de estacionalidad para este virus en diversas investigaciones llevadas a cabo en países de clima templado, en donde se configuró el carácter endémico de la infección23,24,25. En Rio de Janeiro y en Bahia tampoco se observó variación estacional significativa21.

Considerando el agua ingerida por los niños, fue observado un perfil comparable de casos positivos entre los que ingirieron agua mineral, con un 7,8% (11/141), y los que ingirieron agua corriente, con un 6,0% (13/215) de casos positivos. Fue de interés el hecho de que ningún caso de adenovirus entérico se manifestó entre los niños que se alimentaban apenas de leche materna, sugiriendo protección. No obstante, tal aspecto puede relacionarse a la franja etaria.

Analizando la alimentación de los niños, se observó un mayor número de casos positivos de adenovirus entérico entre los que ingerían leche materna y también alimentación artificial, con 7,69% dos casos (1/13). Ya los adenovirus no entéricos fueron más frecuentes en los niños que ingerían solamente leche materna, con 7,7% (1/13) de los casos positivos. Este dato sugiere que la madre puede haber transferido al bebé parte de sus inmunoglobulinas contra el adenovirus durante el amamantamiento. Es de destacar la aparente inexistencia de investigaciones pasadas debidamente publicadas, abordando la ocurrencia de estudios en relación al amamantamiento ofrecido al niño.

En nuestro estudio, los adenovirus fueron detectados en 9,1% (15/164) de los casos utilizando ambas técnicas, o sea, EIA e inmunocromatografía. Comparando las técnicas de EIA e inmunocromatografía, el test inmunocromatográfico mostró una sensibilidad de 83,3% y especificidad del 96,2%. Se observó que este test se demostró bastante satisfactorio para selección de adenovirus; sin embargo, tal sensibilidad aparentemente no se repite en la detección de AdEs. Por lo tanto, este estudio sugiere que el test inmunocromatográfico, como recurso de selección, puede ser utilizado en la rutina de laboratorio para el diagnóstico de adenovirus en niños con gastroenteritis.

Comparando la sensibilidad de las técnicas utilizadas en este estudio, no se observó una concordancia total entre los resultados obtenidos por EIA, inmunocromatografía, cultivo de células y PCR. La técnica de PCR se mostró más sensible que las demás, seguida por EIA, la inmunocromatografía y el cultivo de células.

Los datos obtenidos con relación al tiempo de hospitalización muestran que los niños con AdE pasaron, en promedio, seis días internados y aquellos con AdNe permanecieron hospitalizados en promedio, tres días.

 

CONCLUSIÓN

Los resultados obtenidos en este estudio confirman la circulación de esos virus en la Ciudad de Belém, Estado de Pará, demostrando su importancia en las infecciones en niños y causando gastroenteritis.

 

REFERENCIAS

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Correspondência /Correspondence / Correspondencia:
Elza Caroline Alves Muller
Instituto Evandro Chagas
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Tel: +55 91 3214-2085
E-mail:elzamuller@iec.pa.gov.br

Recebido em / Received / Recibido en: 22/3/2010
Aceito em / Accepted / Aceito en: 18/8/2010