ARTIGO ORIGINAL

Produção de hemócitos de caramujos da espécie Biomphalaria glabrata após a exposição a diferentes protocolos de infecção por Schistosoma mansoni

Daniel Valle Vasconcelos Santos^I; Marco Antonio Vasconcelos Santos^II; Izabel Raimunda de Carvalho Rodrigues^II

^ILaboratório de Biofísica Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém, Pará, Brasil
^IILaboratório de Parasitoses Intestinais e Malacologia, Seção de Parasitologia, Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil

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Título original: Hemocyte production in Biomphalaria glabrata snails after exposure to different Schistosoma mansoni infection protocols. Traduzido por: André Monteiro Diniz.

RESUMO

O objetivo deste artigo foi determinar o perfil do sistema de defesa celular durante a infecção mansônica. Especificamente, este estudo avaliou o número de hemócitos produzidos e liberados na hemolinfa em resposta à infecção pelo parasita. A quantificação dos hemócitos de Biomphalaria glabrata foi realizada em grupos de caramujos previamente infectados com 5, 10, 15 ou 30 miracídios de Schistosoma mansoni nos dias 1, 5, 10, 15, 20 e 30 pós-infecção. Os resultados revelaram que B. glabrata possui um mecanismo de defesa celular caracterizado pela liberação de hemócitos na hemolinfa. O maior registro de produção celular ocorreu 24 h após a infecção e houve uma redução significante na concentração de hemócitos durante os 10 dias seguintes. No entanto, no dia 15 pós-infecção, houve um segundo aumento na produção de hemócitos, porém não tão acentuado como o primeiro pico. No dia 30 pós-infecção, foi observado outro aumento moderado da produção de hemócitos. Com base neste perfil de resposta celular, o sistema de defesa do caramujo aparenta ser eficiente nos momentos imediatamente posteriores à infecção, mas essa resposta não assegura a destruição de todos os parasitas no curso da infecção.

Palavras-chave: Biomphalaria; Schistosoma mansoni; hemócitos.

INTRODUÇÃO

A resistência de caramujos do gênero Biomphalaria à infecção pelo parasita Schistosoma mansoni é diretamente relacionada à capacidade dos hemócitos do vetor de realizar a fagocitose e destruir parasitas recém-introduzidos^1,2,3,4. Os hemócitos são a principal linha de defesa dos moluscos contra parasitas e bactérias⁵. Acredita-se que essas células se originem do órgão produtor de amebócitos⁶, apesar de alguns autores terem sugerido que essas células especializadas podem ter uma origem multicêntrica^7,8.

A encapsulação dos miracídios ocorre imediatamente após a penetração do parasita e é determinante para a sobrevivência ou morte do parasita em seu hospedeiro^9,10. Basch¹¹ demonstrou que este processo pode ser alterado por diversos fatores, como o status nutricional do vetor, a virulência da cepa do parasita, a quantidade de hemócitos hemolinfa, alguns aspectos ambientais diretos e na indiretos e o número de miracídios que conseguem penetrar no hospedeiro.

O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de produção de hemócitos de espécimes de caramujos da espécie Biomphalaria glabrata mantidos em cativeiro após a infecção experimental por diferentes quantidades de miracídios de S. mansoni. A caracterização da variabilidade da produção de hemócitos é fundamental para a compreensão dos mecanismos de resistência de diferentes espécies de Biomphalaria à infecção por S. mansoni.

MATERIAL E MÉTODOS

Cepas brasileiras albinas (não pigmentadas) e pigmentadas (selvagens) de B. glabrata diferem em sua suscetibilidade à infecção por S. mansoni¹². Os espécimes de B. glabrata utilizados neste estudo eram descendentes de caramujos capturados na região Bragantina do Estado do Pará, Brasil. Esta colônia de caramujos foi mantida em cativeiro em tanques especiais no Laboratório de Parasitoses Intestinais e Malacologia do Instituto Evandro Chagas, Estado do Pará. A cepa de S. mansoni utilizada foi extraída de camundongos infectados no próprio laboratório, previamente isoladas de caramujos capturados em reservatórios de água doce na Cidade de Belém, Estado do Pará.

O fígado dos camundongos infectados foi macerado, filtrado com gaze e submetido a sedimentação espontânea. O sedimento foi exposto à luz por 45 min e os miracídios foram coletados com o uso de micropipetas e um estereomicroscópio (Zeiss, Stemi SV 11).

Um total de 752 caramujos de aproximadamente oito meses de idade e 1,5 cm de diâmetro de concha foram individualmente infectados em frascos de vidro com 2 mL de água potável sem cloro com 5, 10, 15 ou 30 miracídios. A infecção foi considerada de sucesso nos casos em que nenhum miracídio foi visualizado no recipiente após 90 min de exposição à luz. Após este procedimento, os moluscos foram transferidos para aquários especiais devidamente etiquetados com o seu protocolo de infecção. O grupo controle era composto por 52 caramujos não infectados da mesma colônia inicial.

As amostras de hemolinfa (20 µL) foram coletadas por meio de punção direta em cada caramujo nos dias 1, 5, 10, 15, 20 e 30 pós-infecção para avaliar a quantidade de hemócitos circulantes. As amostras foram diluídas em solução de Turk (0,1% violeta cristal em 1% de ácido acético glacial) a uma proporção de 1:1; foram colocados 5 µL da solução resultante em cada uma das laterais de uma câmara de Neubauer. Por fim, cada amostra de hemolinfa foi analisada em duplicata utilizando-se um microscópio ótico (Leitz, Dialux 20 EB) 100X e 400X .

Os resultados são apresentados como os valores médios e os desvios padrões. As diferenças entre os valores de cada grupo foram avaliadas por meio de uma análise de variância (ANOVA) e teste † de Student (α = 0,05). Todas as análises estatísticas foram realizadas com o programa BioEstat^® 5.0 (IDSM/MCT/CNPq).

RESULTADOS

Dos 752 caramujos infectados, 8% morreram no curso da infecção e não houve qualquer correlação entre a taxa de mortalidade e o número de miracídios utilizados. Portanto, foram utilizados 710 caramujos na quantificação dos hemócitos circulantes. Esses caramujos foram divididos em 24 grupos de aproximadamente 30 indivíduos; o grupo controle era composto por 52 espécimes. Um resumo desses resultados pode ser observado na tabela 1.

Houve um pequeno aumento (9,7%) na contagem de hemócitos circulantes no grupo infectado por cinco miracídios, porém estes valores não foram considerados significantes se comparados com o grupo controle. No entanto, houve um forte aumento na produção de hemócitos 24 h após a infecção nos grupos que foram infectados com os números mais altos de miracídios. A produção de hemócitos aumentou em 130,07%, 121,78% e 104,71% nos grupos que receberam 10, 15 e 30 miracídios, respectivamente. Após cinco dias de infecção, houve uma redução significante no número de hemócitos em cada um dos grupos de caramujos, apesar de o grupo que havia sido infectado com cinco miracídios ter apresentado uma produção menor do que os outros grupos experimentais (p < 0.05).

Em todos os grupos, a menor quantidade de hemócitos circulantes foi observada no dia 10 pós-infecção e o grupo que havia sido infectado com 30 miracídios experimentou a menor redução.

No dia 15 pós-infecção, a contagem de hemócitos circulantes aumentou proporcionalmente à carga inicial de parasitas e esta tendência permaneceu até o dia 20 pós-infecção. No dia 30 pós-infecção, a produção celular estabilizou-se e não foram observadas diferenças significantes entre os grupos experimentais. Estes resultados podem ser visualizados na figura 1.

Após 24 h da infecção, houve uma forte correlação inversa entre a contagem de hemócitos circulantes e o número de miracídios utilizados para causar a infecção (r = 0.99; p < 0.01). Esta relação foi invertida no dia 10 pós-infecção (r = 0.91; p < 0.05) e manteve-se até a última fase da infecção (r = 0.97; p < 0.05) (Figura 2).

DISCUSSÃO

Os hemócitos, que são células ameboides móveis, são constituintes importantes do sistema de defesa dos caramujos do gênero Biomphalaria contra a infecção por miracídios de S. mansoni^3,13. Estas células formam a barreira primária contra parasitas e bactérias invasoras^13,14; a mobilidade de seu citoesqueleto e as adaptações de suas membranas plasmáticas encapsulam organismos externos¹⁵ e essas células também colaboram com diversos fatores humorais de defesa. Muitos estudos têm procurado elucidar a interação complexa entre parasita e hospedeiro existente neste modelo^16,17,18,19.

Neste artigo, foram avaliadas as variações nas contagens de hemócitos circulantes de caramujos da espécie B. glabrata após a exposição a diferentes quantidades de miracídios de S. mansoni. O principal achado deste estudo foi o aumento significativo na produção de hemócitos apenas quando mais de cinco miracídios penetraram no caramujo. Este acréscimo foi seguido de uma diminuição considerável na contagem de hemócitos 24 h após a infecção, aumento este que persistiu durante os primeiros 10 dias pós-infecção. No dia 15 pós-infecção, iniciou-se uma retomada na produção de hemócitos nas células e o nível de hemócitos tornou-se estável no dia 30 pós-infecção. Além disso, este comportamento mostrou-se independente da carga parasitária inicial. Houve uma forte correlação negativa entre a contagem de hemócitos e o número de miracídios utilizados para a infecção após 24 h, porém esta correlação foi invertida nos dias 10 e 20 pós-infecção.

Após 24 h da infecção, o aumento médio no número de hemócitos circulantes foi de 93,11%. Stumpf e Gilbertson¹⁹ relataram uma duplicação na contagem de hemócitos de B. glabrata 2 h após a exposição aos miracídios. Resultados semelhantes foram obtidos Joky et al²⁰ and Jeong et al¹³; houve um aumento no número de hemócitos de B. glabrata imediatamente após a exposição a um número menor de miracídios, redução esta que foi seguida de um pico na produção celular nos dias 3 e 4 e uma diminuição acentuada no número de hemócitos nos dias 6 e 7. Martins-Souza et al²¹ caracterizaram os hemócitos vivos presentes após a infecção por esquistossoma por meio de análise citométrica e identificaram o pico na produção de hemócitos 24 h pós-infecção.

Esses dados embasam os resultados no que diz respeito ao aumento na contagem de hemócitos durante as primeiras horas após a penetração de miracídios e ao posterior declínio   nos números de hemócitos circulantes^22,23,24.

Este estudo também demonstrou que, após a exposição ao S. mansoni, o nível de hemócitos na hemolinfa manteve-se mais alto do que no grupo controle e por mais tempo do que o relatado em pesquisas anteriores²⁵. Este achado corrobora a potencial existência de um efeito duradouro sobre os hemócitos, que provavelmente consiste em fatores humorais, após a reação do caramujo aos organismos invasores.

Este estudo também demonstrou que o número de miracídios infecciosos é um fator determinante para a magnitude da resposta celular à infecção por esquistossoma. Por exemplo, o número de hemócitos produzidos nas primeiras 24 h pós-infecção foi bem maior em moluscos infectados com 10, 15 ou 30 miracídios do que nos infectados com cinco dessas larvas.

Em relação à dinâmica da resposta celular hemocítica dos   moluscos  aos   miracídios   invasores,   estudos anteriores^9,10 registraram a interação ou adesão dos hemócitos à superfície do parasita 3 h após a penetração das larvas. Sete horas e meia depois deste contato, os hemócitos fagocitaram as microvilosidades na superfície do parasita. Vinte e quatro horas depois, foram observados uma grande atividade hemocítica, processos de encapsulação e a formação de grandes fagossomos. 48 h mais tarde, foram encontradas cápsulas com muitos hemócitos contendo um grande número de fagossomos. No quarto dia, entretanto, essas cápsulas apresentavam-se em número bem menor.

Os resultados obtidos por Cheng e Garrabrant¹² após o estudo de duas diferentes cepas de B. glabrata (PR-albino e 10-R2) infectadas por S. mansoni demonstraram que os níveis de fosfatase ácida na hemolinfa aumentaram oito vezes após 24 h de infecção pela cepa 10-R2, em comparação com o grupo controle não infectado. No entanto, houve apenas um aumento discreto desses níveis no mesmo período para o grupo infectado pela cepa PR-albino. Em relação ao número de hemócitos, os resultados foram completamente inversos. A cepa PR-albino induziu um pico na produção de hemócitos durante as primeiras 12 h de infecção, o qual foi seguido de uma acentuada redução na quantidade de hemócitos circulantes, enquanto que a cepa 10-R2 não alterou de forma significativa a contagem de hemócitos durante o processo infeccioso, o que indicou que a fosfatase ácida pode ter um papel importante na regulação da produção de hemócitos após a exposição ao parasita.

CONCLUSÃO

A dinâmica do processo de fagocitose, que foi observada até o quarto dia pós-infecção, sugere que a mobilização dessas células defensivas só é eficiente durante a primeira fase do processo infeccioso após um grande número de parasitas ter penetrado no caramujo. Além disso, essa mobilização não garante a eliminação das larvas no curso da infecção. A reação de defesa do molusco contra as larvas do parasita poderia ser mais eficaz se não fosse regulada apenas por um processo celular, mas também por mecanismos bioquímicos que estimulariam diretamente os órgãos hematopoiéticos a produzirem mais hemócitos.

AGRADECIMENTOS

Os autores gostariam de agradecer a Rosângela Barros do Nascimento, Carlos da Silva Faria e Bruno Silva de Lima, pelo apoio técnico durante toda a pesquisa, e a Kauê Machado Costa, pela revisão crítica e suas valiosas sugestões.

APOIO FINANCEIRO

Instituto Evandro Chagas / Fundação Nacional de Saúde.

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Received / Recebido em / Recibido en: 27/5/2011
Accepted / Aceito em / Aceito en: 1/9/2011