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INTRODUÇÃO
Grandes quantidades de agrotóxicos são utilizadas nas lavouras e, dentre eles, os fungicidas lideram o ranking de consumo. A utilização de fungicidas na agricultura tem se intensificado, causando grande impacto nos solos e na biota em que eles se encontram. Desde os anos 1960, os fungicidas provenientes dos ditiocarbamatos têm sido mundialmente aplicados nas plantações, devido ao seu amplo espectro de ação sobre vários microrganismos, abrangendo cerca de 400 patógenos1,2.
Dentre os agrotóxicos empregados, o fungicida Mancozeb é o mais utilizado3. O Mancozeb é um fungicida com ação de contato, atua na inativação das enzimas essenciais para o crescimento e desenvolvimento dos fungos, sendo largamente utilizado nos sistemas agrícolas, nas culturas de arroz, café e couve.
O Mancozeb, de nome comercial Dithane* NT é um fungicida do grupo dos carbamatos, e atua de forma inespecífica nas membranas dos fungos, inibindo a ação proteica e enzimática4. A presença desses compostos no solo vem acarretando modificações no comportamento dos microrganismos, que passaram a adquirir estratégias de sobrevivência à presença desses produtos5. Inúmeras são as referências sobre a biodegradação de agrotóxicos por microrganismos, demonstrando que, devido ao alto potencial genético que apresentam, estes são capazes de degradar essas substâncias ao ponto de mineralizá-las.
Diversos gêneros e espécies possuem a capacidade de degradar certos poluentes como moléculas de xenobióticos, em diferentes ambientes, atuando sobre esses produtos especialmente em consórcio6. Com o intuito de encontrar bactérias que se proliferem em ambientes com a presença de agrotóxicos e sejam capazes de realizar a biorremediação deste meio, os objetivos deste trabalho foram: isolar bactérias de solo com histórico de aplicação do fungicida Mancozeb em lavoura de Allium fistulosum L.; identificar os isolados com ensaios bioquímicos e ferramentas moleculares; obter o crescimento dos isolados em meio mínimo acrescido do fungicida; estabelecer uma coleção de bactérias com potencial de biorremediação.
MATERIAIS E MÉTODOS
OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS
As amostras foram coletadas no período da manhã, na região rizosférica da cultura de cebolinha (Allium fistulosum L.). Coletaram-se cinco subamostras, as quais foram homogeneizadas, para formar uma amostra composta. Esta foi acondicionada em saco plástico esterilizado devidamente identificada e armazenada a -4° C no Laboratório de Genética da Faculdade de Ciências Agrárias no Campus da Universidade Federal do Amazonas.
ISOLAMENTO BACTERIANO
As bactérias foram isoladas em meios seletivos contendo agrotóxicos como única fonte de carbono. O fungicida utilizado foi o Mancozeb, de nome comercial Dithane* NT, cuja dose recomendada para controle como fungicida nas lavouras, é de 2 a 3 kg por ha-1. Por essa razão pesou-se 200 g de solo rizosférico, mantido em incubadoras de 5,0 L com 3 L do meio Bushneel Haas BH: MgSO4.7H2O, (0, 20 g); K2HPO4 (1,0 g); NH4NO3 (1,0 g); FeCl3.6H2O (0,05 g); CaCl2 (0,02 g) e o meio de cultivo quimiostático (K2HPO4, 2,75 g; (NH4)2SO4, 1,0 g; MgCl2.6H2O, 0,2 g; NaCl, 0,1 g; FeCl3.6H2O, 0,02 g; CaCl2, 0,01 g; H2O destilada 999 mL mais 1 mL de elementos traços: H2BO3, 1,5.10-4%; MnSO4, 8,0.10-5%; ZnSO4.7H2O, 6,0.10-5%; CuSO4.5H2O, 2,5.10-6%; CaSO4.7H2O, 1,0.10-7), tendo como única fonte de carbono o Dithane* NT a 3,6 g L-1.
A incubação ocorreu a 28° C por sete dias. Após esse período, 100 mL do meio fermentado foi retirado e inoculado novamente em 3 L do mesmo meio anteriormente citado e incubado por mais sete dias nas mesmas condições de cultivo. Esse procedimento foi repetido por mais duas vezes, quando então ocorreu a diluição em série (10-1, 10-2, 10-3, 10-4) do meio de cultivo da última fermentação e semeadura em placas de Petri em meio BH e quimiostático7. Para obtenção das culturas isoladas repicaram-se todas as colônias de microrganismos que se desenvolveram nas placas e fez-se a purificação pela técnica de esgotamento por estrias. Após terem sido purificadas, as mesmas foram devidamente identificadas e armazenadas em triplicata, em microtubos de 1 mL (310 µL da cultura crescida em meio Luria-Bertani - LB - (Triptona - 1 g de extrato de levedura - 0,5 g, NaCl - 1 g), e 690 µL de glicerol 50%, autoclavados e guardados a -80° C.
Identificação fenotípica
A identificação fenotípica das bactérias ocorreu submetendo os isolados bacterianos a 16 ensaios bioquímicos por meio dos quais verificaram-se as reações metabólicas dos microrganismos e as características morfológicas das colônias8. A partir dessas características, usou-se o Manual de Bergey's de Sistemática Bacteriológica9 e o Manual de Microbiologia Clínica para Controle de Infecções de Serviços de Saúde, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária10, possibilitando identificar os isolados em nível de gênero.
Os 16 ensaios foram: método de coloração de Gram, verificação de enzimas de oxidase, catalase, ensaios de oxidação e fermentação, motilidade, produção de H2S, utilização de ureia e citrato, provas fermentativas com glicose, inositol, dulcitol, arabinose, ensaio de fermentação de lactose, hemólise e verificação de enzimas de α, ß-amilase e triptofanase. Em todos os ensaios os materiais utilizados, como placas de Petri, tubos, bem como os meios utilizados, foram devidamente autoclavados a 121° C por 20 min. Os ensaios foram realizados em duplicata e incubados a 30° C por tempo de 18-24 h.
Identificação genotípica
A segunda parte da identificação foi a molecular, na qual se utilizou parte do gene 16S rRNA. A extração do DNA ocorreu pelo método do fenol/clorofórmio modificado11. A amplificação do gene 16S rRNA foi realizada por meio da reação em cadeia de polimerase - PCR, com oligonucleotídeos iniciadores: 530 F (5'TGA CTG ACT GAG TGC CAG CMG CCG CGG-3') e 1492R (5'TGA CTG ACT GAG AGC TCT ACC TTG TTA ACM CGM CTT 3') que amplificam 1.000 pares de bases. A amplificação consistiu de um volume final de 25 µl (MgCl2 50 mM, DNTPs 2,5 mM, 5 pmol/µl de cada iniciador, 1,25 U/µL de Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity, tampão 10X, DNA bacteriano a uma concentração de 30-100 ng, completou-se com água Milli-Q)12. Foi utilizado como controle o DNA bacteriano da Escherichia coli ATCC 25922.
O ciclo de amplificação consistiu no perfil térmico, que se iniciou com a desnaturação inicial a 95° C por 2 min, seguido por 35 ciclos de desnaturação de fitas-molde a 95° C por 40 s; o pareamento dos iniciadores deu-se a 60° C por 40 s e a extensão a 72° C por 1 min. O aparelho utilizado neste procedimento foi um termociclador. A reação de sequenciamento foi processada utilizando-se 2 µL de DNA, purificado (50 ng), em seguida preparou-se o mix da reação: 0,3 µL de ABI Big Dye do kit de reação Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems, EUA) 2 µL do primer 530F e 1492R concentração de 5 pmol/µL; 2 µL de tampão 5X e completou-se com água Milli-Q para um volume final de 10 µL. O perfil térmico consistiu de 25 ciclos, como segue: desnaturação de fitas-molde a 96° C por 10 s, anelamento a 50° C, com extensão a 60° C por 1 min e 20 s.
A reação de sequenciamento foi efetuada usando o kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, EUA), conforme protocolo do fabricante. A seguir, as sequências foram obtidas por eletroforese capilar em sequenciador ABI 3130 (Applied Biosystems, EUA).
A qualidade das sequências obtidas foi avaliada utilizando-se o programa Phred para remoção dos iniciadores, contaminantes e de nucleotídeos de baixa qualidade. As mesmas foram editadas utilizando o programa Bioedit versão 7.1.1113. Cada sequência foi comparada com sequências depositadas no GenBank utilizando-se o programa de busca avançada Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) do National Center of Biotechnology Information (NCBI)14, utilizando-se os parâmetros nucleotide blast, others database set e highly similar sequences.
Para determinar a concentração inibitória mínima (CIM) de Mancozeb sobre as bactérias isoladas, os inóculos foram preparados em caldo mínimo M09 até a turbidez de uma solução padrão de Mac Farland de 0,5 (2 x 108 UFC/mL) e transferidos 1 mL nas concentrações de 0,00011 mgL-1 a 62,5 mgL-1 de Manconzeb para tubos de ensaio de 10 mL de volume. Utilizou-se como controle Chromobacterium violaceum CVMO3. A leitura da CIM foi realizada após 18 h; ao ser determinada, realizou-se o plaqueamento, no mesmo meio, para verificar a ação bacteriostática do fungicida Mancozeb. A CIM, entretanto, não representa um valor absoluto, encontra-se na concentração do ensaio que inibe o crescimento do organismo (ou seja, a leitura da CIM)15.
RESULTADOS
Foram isoladas 23 amostras bacterianas; destas 11 foram selecionadas de acordo com sua maior tolerância ao Mancozeb (Quadro 1), para serem realizadas as etapas de identificação. A partir das características fenotípicas observadas no quadro 2, utilizou-se o Manual de Bergeys9 para identificar os isolados em nível de gênero e espécie. Os isolados 14, 16, 18, 27, 39 e 42 foram identificados como Bacillus sphaericus utilizando-se a chave de Bacillus spp. Os isolados 1, 4 e 7 foram identificados como pertencentes ao gênero Bacillus.
Quadro 1 - Concentração inibitória mínima dos isolados com resistência ao Mancozeb
| Isolado | Família | Espécie | CIM |
|---|---|---|---|
| 1 | Bacillaceae | Lysinibacillus sphaericus | 0,061 mg.L-1 |
| 4 | Lysinibacillus sphaericus | 0,244 mg.L-1 | |
| 7 | Lysinibacillus sphaericus | 0,488 mg.L-1 | |
| 14 | Bacillus sp. | 0,976 mg.L-1 | |
| 16 | Bacillus pumillus | 0,244 mg.L-1 | |
| 18 | Lysinibacillus sphaericus | 0,244 mg.L-1 | |
| 27 | Bacillus sp. | 0,976 mg.L-1 | |
| 39 | Bacillus altitudinis | 0,976 mg.L-1 | |
| 42 | Bacillus aerophilus | 0,122 mg.L-1 | |
| 44 | Enterobactereaceae | Enterobacter sp. | 0,061 mg.L-1 |
| 22 | Pseudomonadaceae | Pseudomonas sp. | 0,122 mg.L-1 |
Quadro 2 - Características fenotípicas de 11 isolados com base na tolerância ao Mancozeb
| Isolados | 1 | 4 | 7 | 14 | 16 | 18 | 22 | 27 | 39 | 42 | 44 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Forma | B | B | B | B | B | B | B | B | B | B | C |
| Gram | + | + | + | + | + | + | - | + | + | + | - |
| Oxidase | + | + | + | + | + | + | + | - | - | + | + |
| Catalase | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Oxidação | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | - |
| Fermentação | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Motilidade | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| H2S | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Indol | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Urease | + | - | + | + | - | + | + | - | + | + | + |
| Citrato | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Lactose | - | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - |
| Hemólise | α | - | β | β | - | A | α | α | - | - | - |
| Arabinose | + | - | + | + | + | + | - | - | + | + | + |
| Dulcitol | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Inositol | + | - | + | + | + | + | - | - | + | + | + |
| Amilase | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
+: Positivo; -: Negativo; B: Bastão; C: Coco; α: Hemólise parcial; β: Hemólise total; A: Hemólise nula.
O isolado 22 foi identificado como Pseudomonas sp, utilizando a chave de identificação dos bastões gram negativos. O isolado 44 não foi possível ser identificado em nível de espécie a partir da utilização da chave da família Enterobacteriaceae, sendo identificado como Enterobacter sp.
No quadro 3 podemos observar a grande similaridade das sequencias de DNA dos isolados (% cobertura) com as amostras do bancos de dados genéticos (genbank).
Quadro 3 - Identificação molecular de 11 isolados com base na tolerância ao Mancozeb
| Isolado | Família | Espécie | % Cobertura | % ID | Gen bank |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | Bacillaceae | Lysinibacillus sphaericus | 100 | 94 | KC188670.1 |
| 4 | Bacillaceae | Lysinibacillus sphaericus | 100 | 99 | KC188670.1 |
| 7 | Bacillaceae | Lysinibacillus sphaericus | 100 | 99 | KC211310.1 |
| 14 | Bacillaceae | Bacillus sp. | 95 | 93 | FR821104.1 |
| 16 | Bacillaceae | Bacillus pumillus | 100 | 99 | NR074977.1 |
| 18 | Bacillaceae | Lysinibacillus sphaericus | 100 | 99 | KC211310.1 |
| 22 | Pseudomonadaceae | Pseudomonas sp. | 100 | 99 | JF293317.1 |
| 27 | Bacillaceae | Bacillus sp. | 97 | 98 | AB126753.2 |
| 39 | Bacillaceae | Bacillus altitudinis | 100 | 99 | KC414719.1 |
| 42 | Bacillaceae | Bacillus aerophilus | 100 | 99 | KC414720.1 |
| 44 | Enterobacteriaceae | Enterobacter sp. | 100 | 99 | KC236536.1 |
DISCUSSÃO
O solo é um ambiente com uma vasta diversidade de microrganismos. No entanto, pouco conhecimento tem-se sobre essa diversidade, principalmente devido aos métodos tradicionais de isolamento e cultivo dos microrganismos16, cujos diferentes meios de cultura propostos para essas práticas têm elevado custo, são de preparo demorado, com ingredientes incomuns, além de alguns resultados serem obtidos após 14 dias. As bactérias representam a maior parte da população microbiana do solo, tanto em quantidade como em variedade; inúmeros são os gêneros e espécies encontrados. Neste trabalho, 81,81% dos isolados foram identificados como Bacillus.
A identificação fenotípica dos Bacillus tem sido considerada complicada17, apesar das chaves propostas para essa identificação. Tal dificuldade ocorre por ter o gênero muitas características, e ser um grupo taxonômico grande, existindo grande variação de características entre linhagens. O gênero Bacillus é considerado um grupo altamente heterogêneo de bactérias Gram-positivas e negativas, o que gera muita complexidade em sua classificação taxonômica. Com recentes estudos da sistemática bacteriana, muitas espécies desse grupo foram reclassificadas, principalmente com uso do gene completo 16S rRNA; porém, devido à elevada variabilidade genética, muitas espécies de Bacillus continuam sem classificação9. Um exemplo de reclassificação é o gênero Lysinibacillus, inicialmente nomeado como Bacillus, gênero este que foi criado para agrupar bactérias que apresentavam características distintas de outras espécies do grupo Bacillus, classificado por Ahmed et al18. Por isso adotou-se, neste trabalho, a junção da identificação fenotípica com a molecular, com o intuito de facilitar esta identificação.
No que se refere à tolerância às drogas, esta é definida como a capacidade da bactéria mostrar-se sensível à CIM do xenobiótico, apresentando maior capacidade de sobreviver na presença deste. Ressalta-se, neste estudo, que os isolados com a mesma identificação em nível de gênero e espécie tiveram resultados de crescimento distintos para as mesmas concentrações do xenobiótico, inferindo que existe diversidade de tolerância para a mesma espécie, informação esta que vem ao encontro da heterogeneidade citada pelos taxonomistas acerca deste gênero.
Usaram-se, como parâmetro para análise de resistência ao xenobiótico, as concentrações aplicadas no campo de acordo com o bula do produto (Dithane* NT) 2 a 3 kg ha-1 ou 430 mg L-1 . Dentre as bactérias identificadas, os isolados de Bacillus sp. (14), Bacillus sp. (27), B. altitudinis (39) apresentaram crescimento em concentrações superiores às utilizadas em campo, o que demonstra que estas apresentaram maior tolerância que as demais. Inúmeras são as espécies isoladas de solos com histórico de aplicação de herbicidas, fungicidas e/ou inseticidas. Esses microrganismos têm apresentado grande potencial de biorremediação para cada produto. Em decorrência desses estudos, diversos metabólitos têm sido produzidos, vários genes e proteínas envolvidos estão sendo conhecidos, aprofundando cada vez mais o conhecimento sobre a degradação e como essa atividade pode ser utilizada amenizando o impacto dos agrotóxicos sobre os solos e, consequentemente, sobre a saúde humana e dos animais.
Mandal Kousik et al19 isolaram diferentes espécies de Bacillus identificados como: Bacillus sp., B. mycoides, B. funiculus, B. marisflavi, B. weihenstephanensis, de solos contaminados com o finopril, em campos de produção de cana-de-açúcar. Este inseticida é utilizado no controle de vários insetos e pragas, e apresenta alta resistência no solo. Experimentos de biodegradação foram conduzidos no laboratório, no qual se analisou a dissipação do inseticida e seus metabólitos formados.
Scopel20 isolou do solo cepas com resistência ao glifosato. Este herbicida é intensamente utilizado no controle de plantas espontâneas, em diversas culturas. Bactérias foram isoladas de solos cultivados com macieira e crescidas em meios adicionados de 300 µgmL-1, e foram identificadas como Pseudomonas sp., P aeruginosa, Serratia sp., e Arthrobacter sp. A capacidade de degradar essa substância foi avaliada em 32 dias, atingindo um percentual de 99,8% de degradação.
Sarkar et al21 isolaram da rizosfera de plantio de chá (Camellia sinensis L.), linhagens de P putida, as quais toleraram altas concentrações do acaricida propargite (10 mgL-1). Contudo, a degradação mostrou-se bastante superior quando o meio mineral utilizado no crescimento das linhagens foi acrescido de glicose. A degradação então atingiu 79,3% em 24 h, para 32% em meio mineral sem glicose no mesmo período.
Singh et al22 avaliaram, a partir de solos contaminados com malation, o percentual de degradação por Brevibacillus sp. e Bacillus cereus. Ambos os gêneros apresentaram altos percentuais de degradação, 72,20% e 87,40% respectivamente. Do mesmo modo Batisson et al23 isolaram Bacillus sp. e Arthrobacter sp. capazes de degradar o mesotrione, um herbicida amplamente utilizado nas lavouras de milho.
As referências citadas corroboram a identificação dos isolados deste trabalho ao gênero Bacillus, os quais se destacam em ambientes contaminados, inclusive utilizando esses xenobióticos como fonte de nutrientes em seu metabolismo.
Por conseguinte, as abordagens fenotípica e molecular possibilitaram a identificação taxonômica de todos os 11 isolados. A partir dos resultados foram identificados três famílias, seis gêneros e oito espécies. As características fenotípicas observadas corroboraram os resultados obtidos pela análise de sequências do gene 16S rRNA. A família Bacillaceae foi a mais representativa neste estudo; todas as famílias e os gêneros identificados possuem referências com biodegradação de pesticidas.
CONCLUSÃO
Obteve-se, a partir de solos com histórico de aplicação do fungicida Mancozeb, 11 isolados, compondo assim uma coleção de microrganismos capazes de crescerem em meio sintético, em diferentes concentrações do produto. Essas condições de crescimento caracterizam as bactérias como tolerantes a esse produto em concentrações superiores a encontradas no campo. A coleção de microrganismos decorrentes da realização dessa pesquisa poderá servir para estudos futuros envolvendo a biodegradação de xenobióticos.
