INTRODUCCIÓN

El herpesvirus humano-3 (HHV-3), también conocido como virus de la varicela-zóster (VVZ) de la subfamilia Alphaherpesvirinae, género Varicellovirus, presenta como principal característica la capacidad de establecer latencia. La partícula intacta del VVZ mide de 180-200 nm de diámetro, con genoma lineal de ADN doble cadena de 125 kb, contenido en un duramen de 75 nm dentro de una nucleocápside. Así como otros herpesvirus, el VVZ tiene regiones únicas largas y cortas, una región de repetición terminal (TR) y otra invertida (IR), dentro de las cuales se encuentran los genes duplicados, además de las regiones internas de repeticiones R1 a R5^1,2.

El VVZ puede causar varicela durante la infección primaria, estableciendo posteriormente una infección latente. En diversas situaciones, en las que ocurre una disminución de la inmunidad celular específica contra el VVZ puede haber una reactivación de la replicación viral, con posibilidad de manifestación clínica por medio del herpes zóster³. La vacuna con el VVZ atenuado estirpe Oka/Merck, licenciada en los Estados Unidos de América (EUA), cuando aplicada en dos dosis con un intervalo de tres meses, presenta 85% de eficacia en la prevención contra la varicela y 95% contra enfermedad grave que requiere terapia antiviral, siendo bastante segura y bien tolerada por niños saludables. Eventos adversos, tales como herpes zóster posvacunal, son raros y ocurren en la mayoría de los casos en inmunocomprometidos⁴.

Para distinguir la estirpe Oka (utilizada en vacunas) del tipo "salvaje" de VVZ, diversos estudios combinaron las técnicas de polimorfismo en el largo de fragmentos de restricción (RFLP) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para producir métodos de laboratorio con relativo grado de éxito para uso en la rutina. Esos métodos muestran la divergencia genética en las ORF38 y ORF54 del genoma viral, las que tienen como producto, respectivamente, las siguientes glicoproteínas (gp): gp40, una proteína tegumentaria que interactúa con los microtúbulos de la célula en la formación de la partícula viral y gp55, una proteína tegumentaria estructural denominada de proteína portal de la cápside^5,6,7,8,9.

A través de técnicas de PCR y RFLP, dos regiones clivadas por enzimas de restricción correspondientes a polimorfismos en polimorfismo de nucleótido único (single nucleotide polymorphisms - SNP) del VVZ han funcionado como poderosa referencia puntual para la caracterización epidemiológica y geográfica de las variaciones de las estirpes¹⁰. SNPs son regiones que contienen variaciones únicas de pares de bases¹⁰. En el caso del VVZ, a partir de 2000, sus SNPs se caracterizaron a partir de metodologías de genotipado publicadas por dos grupos, uno norteamericano y otro inglés^11,12,13,14.

Las dos metodologías de SNP basadas en genotipado difieren en sus enfoques. El método de SNP disperso, desarrollado por el Grupo de Breuer, en el Reino Unido, se basa en ensayos de movilidad heterodúplex para identificar 92 polimorfismos en 37 ORFs distribuidos uniformemente por el genoma del VVZ. Ese grupo de investigación identificó tres genotipos filogenéticamente distintos circulando en el Reino Unido y un cuarto en Japón^2,11,14.

El grupo norteamericano (Universidad de Iowa, Iowa, EUA), liderado por Grose, hizo la secuenciación de cinco genes de glicoproteínas, entre esos la ORF que codifica la mayor proteína de transactivación inmediata (IE62)¹⁵. Sesenta y un polimorfismos, 21 en las glicoproteínas y 40 en la ORF62, fueron identificados¹². El análisis filogenético de esas regiones identificó cuatro clases¹⁶.

Un tercer grupo de investigación, liderado por Schmid en el Centers for Disease Control and Prevention (CDC), localizó un fragmento de 447 pb en la ORF22, región denominada de "up stream" C-terminal, el cual fue suficientemente polimórfico para permitir la identificación de cuatro subtipos virales¹³. Loparev et al¹³ analizaron variaciones genotípicas utilizando un fragmento de 447 pb de la región ORF22 (específicamente las posiciones nucleótidas 37902, 38055, 38081, 38177 y 38229), que tienen como producto la gp24, una gran proteína estructural que hace parte del tegumento viral, con localización subcelular en el virión^1,13. La diversidad nucleótida de esta secuencia se usó para definir el genotipo de 326 aislados de VVZ de muestras de cinco continentes¹³.

El uso de las endonucleasas de restricción PstI y Bgll, permitió identificar los sitios de clivaje para estas enzimas en la ORF38 y ORF54, respectivamente. Diversas estirpes aisladas en los EUA contienen un sitio de restricción de la enzima PstI en la región ORF38, en donde ocurre una sustitución del nucleótido guanina (G) por adenina (A) en la posición 69349 que la estirpe Oka vacunal no posee⁵. Además, una sustitución del nucleótido citosina (C) por timina (T) en la posición 95241 resulta en la eliminación del sitio de restricción de la enzima BglI, localizada en ORF54, la cual se encuentra en todas las estirpes japonesas y que está ausente en muchos aislados de los EUA^6,7,8,9. De esa manera, las estirpes japonesas pueden presentar los genotipos PstI⁺ BglI⁺ o PstI^- BglI⁺, mientras que muchos VVZ aislados en los EUA son PstI⁺ BglI^-6,7,8,9.

En el año 2007, el análisis de esas tres ORFs permitió la clasificación de los genotipos del VVZ por distribución geográfica en: europeo (E), japonés (J) y mosaico (M)¹⁷.

En total, esos tres grupos de investigación identificaron cinco subtipos virales distintos, aunque ningún grupo haya identificado a todos los cinco. De acuerdo con la conferencia VZV Nomenclature Meeting 2008², realizada el 25 de julio de 2008 en Whitechapel, Londres, Reino Unido, las cepas de VVZ detectadas y caracterizadas por secuenciación de los SNPs serían agrupadas en clases de 1 a 5, sustituyendo los genotipos preconizados en la clasificación del CDC. Las diferentes nomenclaturas utilizadas por cada grupo se presentan en el cuadro 1.

Fuente: Adaptado de Breuer et al², 2010.

Cuadro 1 - Nomenclatura genotípica del VVZ utilizada actualmente 

Loparev et al¹⁸ identificaron SNPs que discriminan los genotipos E1 y E2 en las ORF21, ORF22 [región 2], y ORF50. Un análisis de SNP en cualquiera de estas regiones es suficiente para discriminar cepas E1 de otras europeas. Dos posiciones adicionales en ORF38 (69349) y ORF54 (95241), originariamente usadas para confirmar los eventos adversos de la vacuna Oka, también ofrecen informaciones para genotipado. Esos dos marcadores no son útiles para la vacuna Oka específicamente, pero sirven para distinguir algunas cepas J, M1, M2 y M4¹⁹ de otros genotipos. Un subconjunto de aislados de genotipo J (por ejemplo, pOka, que fue la fuente para la vacuna de virus Oka) contiene un sitio de restricción PstI en la ORF38 y ORF54 incluyendo la secuencia de un local de restricción Bgll común a genotipos J, M1, M2 y M4^2,13.

El genotipo E fue identificado en cepas obtenidas de pacientes de Alemania, Islandia, República Checa, Polonia, Rusia europea, Bielorrusia, Ucrania, Lituania, Letonia, Moldavia y Estonia^13,20. Ese genotipo también fue el más prevalente en Asia, Rusia, Kazajistán, este de Australia, Canadá, Estados Unidos, Jordania, Chile y Nicaragua, mostrándose altamente cosmopolita. Con base en el análisis de los aislados obtenidos a partir de varios locales geográficos distintos, el genotipo E mostró un grupo de bases conservadoras en el perfil de los SNPs de la ORF22 y todas las cepas E también presentaron el estándar de marcador PstI Bgll. Una observación sorprendente fue el descubrimiento del dominio geográfico de cepas del genotipo M en áreas tropicales y subtropicales, como África (Congo, República de Chad, Marruecos y Guinea Bissau) y en Asia (India, Bangladesh, Nepal y China)^13,21.

Además de las cepas J comunes en Japón, Australia y algunos países del este asiático, los estándares Bgl ⁺ también son comúnmente aislados en climas tropicales (por ejemplo, en África Ecuatorial, India, Bangladesh, en el sur de China, América Central y norte de Australia). En contraste, virus Bgl ^- son comunes en climas templados. Dos aislados Pst ^- Bgl ^- también fueron observados en Austrália^13,18,19,22. De esta forma, para dominancia geográfica, se observaron los genotipos E1 y E2 (Europa), M1 (África) y J (Japón). El predominio de cepas genotipo E en América del Norte y Australia probablemente, se estableció durante la colonización europea en los siglos XVI y XVII. Cambios relativamente recientes en la inmigración y/o patrones de viajes internacionales para ciertas regiones geográficas (principalmente Europa, Australia y Estados Unidos) han ocasionado la cocirculación de una variedad de genotipos de VVZ^{13,17,19,20,23,24,25,26,27}.

Un genotipo propuesto como recombinante de VVZ de muestras de Brasil fue clasificado como una estirpe del genotipo M¹⁹. De diez aislados obtenidos de forma independiente en Brasil, ocho estirpes tipo M y dos del genotipo E tenían estándares de SNP similares a los descritos por Barrett-Muir et al^13,28.

En Brasil, la mayor parte de los estudios involucrando varicela y herpes-zóster considera apenas los aspectos sintomatológicos^{29,30,31,32,33}. Siendo así, este estudio tuvo como objetivo permitir el conocimiento de estirpes circulantes del VVZ en la región metropolitana de Belém, Estado de Pará, Brasil y poner a disposición informaciones importantes de identificación y distribución de los genotipos del VVZ, en las diversas franjas etarias investigadas y/o asociadas a una determinada patología.

MATERIALES Y MÉTODOS

RESULTADOS

SNP UTILIZADOS PARA GENOTIPADO DEL VVZ

Las muestras de hisopado nasal, oral y de vesículas fueron analizadas en la PCR. De 93 muestras, apenas 26 individuos presentaban vesículas y de esos fue recolectado el hisopado. Luego de la realización de la PCR, se amplificaron 50% de las muestras (13/26) e hisopado de vesículas. Las muestras amplificadas y secuenciadas se analizaron con relación a las sustituciones nucleotídicas en cinco posiciones en la ORF22, dos posiciones en la ORF38 y dos posiciones en la ORF54 (Figura 1).

CP: control positivo; CN: control negativo; PM: peso molecular 123 pb.

Figura 1 - Visualización de los productos de las ORFs 22, 38 y 54 luego de PCR 

Las muestras VVZ118686 y VVZ119611 presentaron sustituciones nucleotídicas en las posiciones A38081C de la ORF22 y T95241C, C95300T de la ORF54. Las muestras VVZ118683, VVZ118684, VVZ118685, VVZ118845, VVZ119609, VVZ119701 y VVZ119954 presentaron cambio de nucleótido en la posición G69424A de la ORF38 (Cuadro 2).

Números en las líneas superiores indican ORF y la posición del SNP en el genoma. Las estirpes a seguir fueron definidas como referencia: Dumas del genotipo E; CA123 y DR del genotipo M; pOka y vOka del genotipo J, para comparación de los pares de bases de posiciones donde hubo cambio de nucleótido. El SNP de la ORF54 es el sitio usado en algunos protocolos para discriminar la estirpe vacunal Oka de muchas estirpes desconocidas. El color lila indica mutación individual intraespecífica; verde indica mutaciones comunes con la estirpe de referencia del genotipo E; amarilla indica mutaciones en común con la estirpe Oka parental genotipo J; blanco indica bases en común para ambas estirpes de referencia E y J.

Cuadro 2 - Análisis de variación genotípica utilizando datos de tres ORFs del VVZ 

Los genotipos 1 o 3 se encontraron en 11 muestras VVZ, mientras que dos muestras presentaron el genótipo 5 (Figura 2).

Las estirpes de referencia utilizadas fueron: Dumas, representando el genotipo E; pOka y vOka referencia del genotipo J; VZVi/Philadelphia.USA/73/V[3] referencia del genotipo E; DR y Moroco 1 referencia del genotipo M; y CA 123 referencia del genotipo M. Los valores de bootstrap (2.000 seudorréplicas) están indicados en los nudos del árbol.

Figura 2 - Análisis filogenético utilizando el método de unión de vecinos (NJ) basado en el polimorfismo nucleotídico de la ORF22 (447 pb), involucrando 13 muestras de los Municipios de Belém, Ananindeua y Marituba 

El análisis filogenético muestra la distribución de las estirpes dentro de las clases 1 o 3 y clase 5. Estas muestras son oriundas de los Municipios de Ananindeua (siete casos de varicela y uno de herpes-zóster), Belém (tres casos de varicela y uno de herpes-zóster) y Marituba (un caso de varicela). La descripción de las estirpes y las secuencias de las muestras analizadas se registraron en el GenBank (Cuadro 3).

* Descripción de la estirpe: espécimen (representado por la sigla del virus "VZV" y la letra "s" sigla de la palabra specimen, ambas descritas en inglés), lugar de origen de la muestra (ciudad y país), período de la recolección (semana y año de la recolección), tipo (muestra de origen de casos de varicela "V" o zóster "Z") y la clase a que pertenece la estirpe.

Cuadro 3 - Descripción de las estirpes y números de acceso en el GenBank 

DISCUSIÓN

Este es un estudio inédito de investigación genotípica del VVZ en la Región Norte de Brasil, adoptando SNP para analizar las diferencias entre las clases 1 o 3 y clase 5^2,13,15. La preferencia por ese método se basó en el hecho de que las técnicas de genotipado generalmente utilizadas en el laboratorio deben ser de ejecución simple y capaces de alcanzar resultados satisfactorios en muestras con cantidad limitada de ADN, como, por ejemplo, a partir de vesículas y costras.

Algunos estudios muestran que extracción y purificación de ácido nucleico no siempre son necesarias para realizar la PCR^36,37. La amplificación del material se vuelve rápida, sensible y con un costo efectivo menor, principalmente cuando son analizadas muchas muestras³⁴. Las muestras de este estudio fueron sumergidas en solución de agua destilada y almacenadas en congelador a -70º C por varios meses sin deterioro en su calidad, aún después de varios ciclos de congelamiento y descongelamiento.

La PCR de material directo de vesículas es sensible y específica para la detección del VVZ, y especímenes de saliva pueden funcionar como una herramienta de soporte para el diagnóstico en determinados casos en que, luego de la extracción con kit comercial, la PCR no funciona por baja cantidad de ADN viral³⁸.

En este estudio, la PCR se realizó en todas las muestras de hisopado nasal, oral y de vesículas. De 26 muestras recolectadas de vesículas y procesadas en agua destilada sometidas a PCR, 13 (50%) fueron amplificadas. Las muestras se recolectaron del primer hasta el 12º día después del surgimiento de las vesículas en la piel, siendo que las muestras amplificadas se recolectaron entre el primero y hasta el noveno día luego del inicio de los síntomas. Lo ideal es que la recolección suceda hasta el séptimo día, cuando las vesículas todavía están productivas^38,39,40.

Chun et al³⁹, en estudio con niños que presentaron varicela postvacunal, recolectaron muestras de vesículas en hisopo, las almacenaron en frasco estéril y posteriormente realizaron extracción y purificación del ADN del VVZ con kit comercial, con una positividad de 58%. Esos resultados fueron superiores a los encontrados en otros dos estudios, que utilizaban la misma metodología de extracción y purificación, con presencia de ADN del VVZ en 46%⁴⁰ y 35%⁴¹, respectivamente.

Resultados semejantes se encontraron en estudio realizado en Suiza en el cual el ADN del VVZ estaba presente en 21 (47%) de 45 muestras de suero recolectadas hasta los primeros ocho días de la fase aguda de la enfermedad⁴².

El análisis de las secuencias de las ORFs 22, 38 y 54 asoció la semejanza de las estirpes encontradas en esta investigación con las clasificadas dentro de las clases 1 o 3 y clase 5. Del total de 13 estirpes aisladas, apenas dos presentaron un genotipo clase 5, las demás fueron clasificadas en clase 1 o 3. Varios estudios demostraron una distribución geográfica distinta de los principales genotipos del VVZ cuando compararon las regiones de clima templado con las de clima tropical^{19,22,26,28,43,44,45}. El dominio regional de genotipos específicos podría haber sido establecido por el clima y/u otros factores, como interacciones virus-huésped o introducción de estirpes en una población inocua al VVZ, por medio de la inmigración o viajes. Estrategias modernas de genotipado pueden ayudar a resolver esos temas. Las regiones en las que varios genotipos VVZ predominan, y esos datos, combinados con los patrones migratorios históricos humanos, contribuyen para identificar los probables puntos de origen para esos genotipos¹⁹. La presencia de dos tipos diferentes de genotipos en este estudio puede estar asociada a uno o más de esos factores.

En Argentina, un estudio utilizando la misma técnica de análisis de la ORF22 en muestras de hisopado de vesículas encontró solamente estirpes de genotipo E (clase 1 o 3) en muestras de 13 niños con varicela⁴³.

Los resultados de este estudio, realizado en la región metropolitana de Belém, también mostraron un predominio de la clase 1 o 3, con 11 muestras de VVZ, y difieren, por lo tanto, del estudio en el cual, de diez muestras de VVZ recolectadas en Brasil, ocho estirpes fueron clasificadas como clase 5 y solamente dos como pertenecientes a la clase 1 o 3^2,13.

El genoma del VVZ es muy estable y la variación en la secuencia del ADN observada ocurre, generalmente, como mutaciones puntuales individuales. Esa justificativa es plausible e indica que un pequeño número de variantes favorecidas ocurre independientemente entre las estirpes de tipo salvaje, en más de una localización geográfica. La literatura destaca que no se puede descartar la posibilidad de que el VVZ de clase 5 haya surgido, primero, en las regiones tropicales, cuando sufrieron mutaciones después que ocurrieron las migraciones humanas para el clima templado. Estirpes clases 1, 2 y 3 pueden haber surgido independientemente de la 5 como resultado del aislado de las islas japonesas y las exploraciones y colonización de los europeos en diversos continentes, respectivamente^2,13.

El análisis de las estirpes circulantes en Brasil permitiría, por ejemplo, la asociación de cuadros clínicos graves a la infección por determinada estirpe. Además, estudios comparando las estirpes vacunales con estirpes VVZ circulantes en el País posibilitarían una evaluación más detallada en relación al aclaramiento de síntomas postvacunales, pues permitiría evaluar si una infección está siendo causada por el virus vacunal o si el individuo adquirió, incidentalmente, el virus salvaje próximo al período de vacunación, asociando el aparecimiento de vesículas a la vacuna.

En India, investigadores observaron, en evaluaciones clínicas, que estudiantes con varicela presentaban vesículas largas con tamaño mayor a 8 mm en diámetro, similar a lo que ocurre con pacientes adultos del sexo masculino infectados por el genotipo clase 5 del VVZ³⁶. Dos regiones del VVZ que han sido utilizadas para investigar las transmisiones hospitalarias son la R1 en la ORF11 y OriS^2,37,38. Sin embargo, los parámetros precisos que informarán su utilización para la investigación de brotes todavía no están establecidos. Los genotipos más asociados con hospitalizaciones de pacientes con varicela continúan desconocidos, y la virulencia de un genotipo puede estar influenciada más por el nivel de respuesta del huésped y su inmunidad que por un genotipo específico^46,47.

Es importante la vigilancia con relación a los tipos de genotipos del VVZ, especialmente para monitoreo de eventos adversos futuros causados por la varicela, y el análisis de polimorfismos en el genoma dl virus en momentos diferentes permitiría estimar su tasa evolutiva⁴⁸.

En este estudio fue posible la evaluación del genotipo de tan sólo dos muestras de pacientes con herpes-zóster. El análisis genotípico en muestras de pacientes con herpes-zóster podría proporcionar una evaluación más detallada de cuanto tiempo determinada estirpe circula en el País (tasa evolutiva) además de evaluar las estirpes más asociadas a la reactivación viral y surgimiento del herpes-zóster años después de la infección primaria por el VVZ.

La infección primaria con VVZ ocurre, generalmente, durante la infancia, alrededor de los 10 años de edad⁴⁹. El herpes-zóster se desarrolla a partir de la reactivación del VVZ y la estirpe aislada en casos de zóster es la misma encontrada en infecciones por este virus adquiridas en la infancia. Por lo tanto, una estirpe de VVZ aislado de una paciente de 70 años de edad con herpes-zóster, en Corea del Sur, probablemente circuló cerca de 60 años atrás, en la década de 1940⁵⁰. En este estudio, la muestra de VVZ a partir de un caso de herpes-zóster en adulto de 65 años de edad, oriundo de Belém, reveló estirpe del genotipo clase 1 o 3, sugiriendo que la misma ya circula por, mínimo, cerca de cinco décadas en Brasil. Otra muestra de paciente con herpes-zóster también fue identificada como clase 1 o 3, este con edad de 45 años, quien siempre vivió en Ananindeua, pero serán necesarios estudios de análisis de tasa evolutiva para estimar mejor el período en que as clases 1 o 3 fueron introducidas en la región.

El análisis de las ORFs 21 y 50 se hace necesario para definir las estirpes de genotipo europeo (E1 y E2) en clase 1 o 3^2,19. Otros estudios de genotipado son necesarios para acompañar el posible impacto de la vacunación en la circulación de genotipos de VVZ en Brasil, además de posibles asociaciones con diferentes cuadros clínicos y la posibilidad de análisis de la tasa evolutiva del virus.

Este es un estudio inédito en Brasil, ya que es la primera vez que el VVZ tiene su genotipo definido por pruebas realizadas en una institución de investigación nacional.

CONCLUSIÓN

Los genotipos del VVZ se clasificaron en clases 1 o 3 y clase 5. El genotipo clase 1 o 3 se encontró en los Municipios de Ananindeua, Belém y Marituba, y el clase 5 fue encontrado apenas en Ananindeua. La PCR fue sensible en 13 muestras de material directo de vesículas, mientras que en muestras de saliva no se obtuvo éxito. La investigación de las ORFs 21 y 50 es importante para definir las clases 1 y 3 en las muestras analizadas. Otros estudios son necesarios para identificar los genotipos del VVZ circulantes en Brasil.