INTRODUCCIÓN

Con el aumento de la expectativa de vida, se ha constatado un significativo aumento de la población de adultos mayores, bien como un incremento en la prevalencia de demencias y enfermedades neurodegenerativas^1,2,3. El aumento de esa parcela de la población con edad superior a 65 años refuerza la necesidad de una comprensión minuciosa a respecto del proceso de envejecimiento y de sus alteraciones y consecuencias.

Aoki et al⁴ afirmaron que la neurogénesis que sucede en el giro dentado del hipocampo, una importante región para la memoria y el aprendizaje en roedores y en humanos, está reglamentada por algunos factores, como exposición a un ambiente enriquecido, actividad física, envejecimiento y estrés. La formación hipocampal, que desempeña un papel fundamental en la memoria espacial, es muy sensible al proceso de envejecimiento, siendo una de las primeras regiones del cerebro a evidenciar cambios morfológicos, fisiológicos y neuroquímicos con el avance de la edad. Bases de pruebas de aprendizaje en ratones sin los dientes molares mostraron que la disfunción oclusal podría estar involucrada en el proceso de degeneración asociada a la demencia senil⁵.

Por otra parte, se describe que el flujo sanguíneo cerebral, en varias regiones del cerebro, es afectado por la masticación, y que los astrocitos pueden desarrollar un papel clave en la regulación de ese flujo^{6,7,8,9,10,11,12}. La regulación de flujo sanguíneo cerebral se hace a través del calcio (Ca²⁺) astrocítico responsables por ondas de señalización que pueden inducir tanto a dilatación como a constricción de las arteríolas por medio de su concentración¹². Los astrocitos son células extremamente numerosas, siendo afectados en varias situaciones neuropatológicas, incluyendo el envejecimiento, la neurodegeneración crónica y la infección. Esas condiciones adversas comprometerían de la misma manera la función sináptica por estar relacionadas a eventos de plasticidad sináptica debido a la liberación de glutamato en áreas críticas para la consolidación de la memoria, como en las regiones hipocampales de CA1 y CA3 (Asta de Amón 1 y 3) y en el giro dentado^13,14,15. Por esos motivos, es evidente que los astrocitos son imprescindibles para la función cerebral normal, y, por lo tanto son esenciales las investigaciones acerca de posibles cambios en su número, distribución y forma.

En estudios previos, por ejemplo, el desempeño en el laberinto acuático de Morris disminuyó en ratones jóvenes y viejos mantenidos en ambiente estándar y privados de actividad masticatoria desde el 21° día postnatal, y esto se asoció con la astrocitosis en la capa polimórfica del giro dentado en los individuos más viejos¹⁶.

Con respecto a la estimulación del medio ambiente, en un estudio con la misma variedad propuesta aquí (ratones albinos suizos), se concluyó que a largo plazo, el enriquecimiento ambiental fue capaz de influir en el número de astrocitos de diferentes capas del giro dentado, así como en el rendimiento de estos animales en las pruebas de comportamiento que evaluaron la

memoria espacial y la memoria similar a la episódica; esto demuestra los efectos del medio ambiente y del envejecimiento sobre la plasticidad glial, efectos también sometidos a investigación en el trabajo presentado¹⁷.

Basado en lo anterior, el presente estudio se propuso, con el auxilio de ensayos inmunohistoquímicos y con el método del fraccionador óptico, a evaluar comparativamente las consecuencias de la dieta de molido grueso y del medio ambiente en la cantidad de astrocitos en la región de CA1 del hipocampo y sus laminaciones.

MATERIALES Y MÉTODOS

Todos los procedimientos experimentales del presente trabajo siguieron los principios recomendados por la publicación Principles of Laboratory Animal Care da National Institutes of Health. Para investigar la influencia de la dieta, del medio ambiente y la edad, se utilizaron hembras adultas jóvenes y viejas de ratones de la variedad albinos suizos, cortesía del Instituto Evandro Chagas y alojados en el bioterio del Laboratorio de Investigación en Neurodegeneración e Infección del Hospital Universitario João de Barros Barreto. Los procedimientos fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética para Experimentación Animal de la Universidad Federal de Pará (CEPAE/UFPA Nº BIO004-09).

Los animales se distribuyeron para formar grupos de edades de 6 meses (6M), 12 meses (12M) y 18 meses (18M), alojados en condiciones empobrecidas (ambiente patrón - AP) o enriquecidas (ambiente enriquecido - AE), y alimentados poco después del destete por dos tipos diferentes de alimentación. El grupo control recibió alimentación en pellet (PE), y el grupo experimental tuvo restricción masticatoria, con harinas de molido grueso y tamizadas (MG). Los sujetos tuvieron acceso libre a comida y agua, y es de destacar que no había diferencias nutricionales entre los alimentos ofrecidos. Aún así, se mantuvo el control de peso quincenal de los animales. De esa manera se generaron, en estas condiciones, seis grupos (Cuadros1 y 2).

Cuadro 1 - Número de animales para cada grupo criado en AP, según la ventana temporal y el tipo de alimento ofertado 

Cuadro 2 - Número de animales para cada grupo criado en AE, según la ventana temporal y el tipo de alimento ofertado 

Los animales del AP fueron alojados en jaulas de plástico de dimensiones 32x39x16,5 cm y cubiertas con una rejilla metálica, que alberga seis ratones. Los grupos alojados en AE estaban inseridos en un espacio de 50x50x50 cm, con dos pisos, equipados con puentes de plástico, ruedas para correr, juguetes y túneles hechos de plástico, lo que permite el ejercicio voluntario durante todo el período. El ambiente sufría cambios semanales, fueran alteraciones en la posición de los objetos o incluso cambiarlos. Cada jaula alojaba 12 ratones. Todas las jaulas se mantuvieron en una habitación a temperatura controlada (23 ± 1º C) y ciclos de luz-oscuridad de 12 h (período de luz de 6-18 horas, período oscuro, 18-6 h).

Al final de cada ventana de tiempo de observación, los animales recibieron dosis letal y anestésico fueron perfundidos con fijadores de aldehído después de la eliminación previa de la sangre circulante con solución salina. Sus cerebros se retiraron y se cortan en vibratome, recogida, en una serie anatómica ordenado, secuencial para el posterior inmunomarcado de proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Una de cada seis secciones con espesor constante de 60 µm, se seleccionaron para la muestra de inmunomarcado, usando el anticuerpo monoclonal GFAP (ratón anti- GFAP MAB360, Chemicon Int., EE.UU.). También se usa para tinción de contraste con violeta al 1% Cresil para definir las diapositivas CA1 y establecer los límites de los cuerpos celulares de astrocitos.

A seguir, se realizaron análisis estereológicos para estimar el número de los astrocitos con el programa especializado Stereo Investigator^® (MBF Bioscience, Williston, VT, EE.UU.). La distribución laminar de CA1 se definió tomando como referencia la camada piramidal. Esta visualización se justifica por el "empacotamiento" de las células en comparación con las células piramidales de CA3. Por lo tanto, se nota en CA1 una camada piramidal más estrecha, pero más densa^18,19. Después de definir el contorno de la camada piramidal en CA1, se proyectaban, paralelamente a la misma, las otras camadas de la región, teniendo en cuenta también las diferencias morfológicas de los astrocitos entre estas capas.

Se obtuvo el número total de astrocitos como una función de probabilidad estimada basado en el espesor de las secciones, en el área de la caja de conteo y en el área de interés muestral. La ecuación matemática que relaciona estas variables entre sí y permite estimar el número total de objetos de interés se define por N = ∑Q * 1/ssf * 1/asf * 1/tsf .

En esta ecuación, N es el número total de los astrocitos; ∑Q es el número de astrocitos identificados por el experimentador; ssf es la fracción del número de secciones del muestreo; asf es la fracción del muestreo; y tsf es la fracción muestral de la espesura de la sección. En este ensayo, adoptamos la matriz muestral

en los ejes XY de 80x80 μm, zona de guarda 2 μm y altura de la caja de conteo de 7 μm.

Los grupos se sometieron a ensayos de normalidad, para identificar las posibles desviaciones y el análisis estadístico paramétrico evaluó el grado de significación de los resultados, utilizando el análisis descriptivo (datos cuantitativos) de la varianza (ANOVA) para tres criterios, seguido de la posprueba de Tukey. El nivel de significación para las diferencias estadísticas se estableció en α <0,05.

RESULTADOS

CA1 Y SUS CAMADAS

Las fotomicrografías de los astrocitos se ilustran en la figura 1. Entre ellas, la de interés y objeto de este estudio: la región de CA1 del hipocampo y sus laminaciones (Stratum lacunosum-moleculare, Stratum radiatum, Stratum oriens y Stratum pyramidale). Utilizando los principios del fraccionador óptico, aplicados a la región de CA1 en las secciones inmunomarcadas, se estimó el número total de astrocitos de esa región para todos los grupos formados.

A: Stratum lacunosum-moleculare de CA1; B: Stratum oriens de CA1; C: Stratum pyramidale de CA1; D: Stratum radiatum de CA1. Escalas: bajo aumento = 250 μm, gran aumento = 25 μm.

Figura 1 - Fotomicrografías de sección horizontal del hipocampo inmunomarcado para GFAP, ilustrando los objetos (astrocitos) y las regiones (camadas) de interés del ratón albino suizo. Hay diferencias en la morfología de los astrocitos en cada camada 

AMBIENTE ESTÁNDAR: NÚMERO TOTAL DE ASTROCITOS Y CUANTIFICACIONES POR CAMADAS

La estimación del número total de astrocitos en CA1 de los animales que vivieron en AP reveló que el envejecimiento impuso al grupo PE una reducción de la población astrocitaria. Los grupos de 12M (28309 ± 392,41; media ± error estándar) y de 18M (28217 ± 2198,96) revelaron un número menor de células cuando comparados al grupo joven (6M = 31143 ± 1885,53) (Figura 2). En contrapartida, en el grupo MG, se evidenció un aumento en el número de astrocitos en el grupo de 12M en relación al de 6M (12M = 34921 ± 2590,57 vs. 6M = 25442 ± 1572,66), siendo esa diferencia significante (p < 0,05). En el de 18M, hubo una discreta disminución (31901 ± 2287,60; no significante) en la cantidad de astrocitos.

Barras conectoras: p < 0,05, de color azul para grupo PE y de color rojo para grupo PO, en diferentes edades, pero en un mismo régimen de dieta y ambiente.

Figura 2 - Representación gráfica del número total de astrocitos en CA1 del hipocampo para los animales con 6M, 12M y 18M, criados en AP y AE y alimentados con PE y PO (promedio del número de astrocitos y error estándar) 

Aliado a eso, se encontraron diferencias importantes entre los dos grupos de dietas a los 12M (PE vs. MG, p < 0,05), bien como un efecto del AE sobre los animales que recibieron MG todavía jóvenes (6M: MG AP = 25442 ± 1572,66 vs. MG AE: 34198 ± 2449,65), siendo que el AE impuso un aumento en la cantidad de astrocitos. Sobre eso, de la misma forma que había sido visto en el AP, hubo una reducción en la cantidad de astrocitos de los 6M a los 12M en el grupo PE (6M = 34841 ± 3091,54 vs. 12M = 25176 ± 1770,57), bien como de los 6M a los 18M en el grupo MG (6M = 34198 ± 2449,65 vs. 18M = 26752 ± 2897,62). De ese modo, los resultados sugieren que tanto la actividad masticatoria como el envejecimiento afectan el número de astrocitos en CA1, incluyendo la interacción entre esas variables (F_(2,36) = 4,22; p < 0,022), así como la interacción de (F_(2,36)= 3,45, p < 0,042); y en la capa oriens (Figura 3B) es la interacción entre las tres variables que induce las alteraciones encontradas (F_(2,36) = 7,24, p < 0,002).

En las capas piramidales y radiatum, la AE fue factor importante en el proceso, ya que en la primera capa, se vio que sólo el medio ambiente (F_(1,36) = 4,29, p < 0,04) o su asociación con el envejecimiento (F_(2,36) = 33.6, p < 0,000001) mostraron diferencias significativas en el número de astrocitos (Figura 3C). Esta última asociación también se encontró en la capa radiatum (F_(2,36)= 8,92, p < 0.00071), bien como en la edad con actividad masticatoria (F_(2,36) = 4,94, p < 0,01) (Figura 3D).

A: Número de astrocitos en la camada lacunoso-molecular de CA1; B: Número de astrocitos en la camada oriens de CA1; C: Número de astrocitos en la camada piramidal de CA1; D: Número de astrocitos en la camada radiatum de CA1; *: p < 0,05 en la comparación entre dietas para una misma edad y ambiente; #: p < 0,05 en la comparación entre ambientes, con la misma edad y régimen de dieta; Barras conectoras: p < 0,05, de color azul para grupo PE y, de color rojo para grupo PO, en diferentes edades, pero en un mismo régimen de dieta y ambiente.

Figura 3 - Representación gráfica del número de astrocitos en CA1 del hipocampo y sus laminaciones para los animales con 6M, 12M y 18M criados en AE y alimentados con PE y PO (promedio del número de astrocitos y error estándar) 

CONTROL DE PESO DE LOS GRUPOS EXPERIMENTALES

Se realizó el control de ganancia de peso ponderal de los animales, una vez que estaban siendo utilizadas raciones diferentes (aunque tuvieran el mismo valor nutritivo). El control de peso fue quincenal y no se observaron diferencias significativas, comparando grupos de dietas diferentes. En el cuadro 3, se presentan el promedio de peso en el día de la perfusión de los animales (final de la ventana temporal) y los valores estadísticos de la comparación entre las dietas.

Cuadro 3 - Valores de promedio de peso y error estándar para los animales con 6M, 12M y 18M criados en AP y AE alimentados con PE y PO y los valores de significación obtenidos en el test t-Student y el p-valor en la comparación de grupos con una misma edad y ambiente, aunque diferente dieta 

DISCUSIÓN

Los astrocitos de CA1 se investigaron sobre posibles cambios en su distribución laminar en correlación a las alteraciones masticatorias de largo plazo, envejecimiento y enriquecimiento ambiental en hembras adultas de ratones suizos albinos de 6M, 12M y 18M. Para cuantificar los cambios, se aplicó el fraccionador óptico, un método estereológico de gran precisión que combina las propiedades del disector óptico y del fraccionador, y que ha sido usado en

una variedad de estudios para determinar el número de células en numerosas regiones cerebrales. El fraccionador óptico no es afectado por los cambios histológicos, retracción o expansión impuestas por posibles procesos patológicos, un tema de particular importancia cuando se estudia el envejecimiento y otras enfermedades que afectan el volumen cerebral. Se halló un efecto diferencial del régimen masticatorio, del envejecimiento y del enriquecimiento ambiental sobre la astrogénesis laminar de CA1 en las diferentes edades. Se identificó, además, que las diferencias impuestas por la dieta y por la edad fueron contrabalanceadas por el enriquecimiento ambiental en todos los estratos de CA1, aunque no en el Stratum pyramidale y en el Stratum radiatum.

Los astrocitos hipocampales demuestran ser particularmente sensibles al envejecimiento^20,21,22 y ser afectados por desequilibrios masticatorios^23,24,25 y cambios ambientales²⁶. Los estudios anteriores usando GFAP revelaron que la exodoncia de los molares acentúa la hipertrofia de los astrocitos y su densidad, y que cuanto más duradera es la condición sin muelas, mayores son esos efectos²⁷. Ninguno de los estudios previos midió, sin embargo, la influencia del enriquecimiento ambiental sobre tales cambios, siendo el presente trabajo la primera iniciativa en ese sentido. Con base en ensayos estereológicos, se documentó también, en hembras adultas de ratones suizos albinos, a los 6M, 12M y 18M, que la distribución laminar de los astrocitos de CA1 es especialmente susceptible a seis o más meses de privación masticatoria, bien como al envejecimiento, y que el AE reduce esa susceptibilidad. Así, el presente trabajo es una descripción basada en método estereológico, sin sesgo de como la distribución laminar y el número de astrocitos en CA1 cambian con la reducción

de la actividad masticatoria, el envejecimiento y el ambiente.

Entre los hallazgos presentados, está el hecho de que el número de astrocitos, en el Stratum pyramidale, a los 18M, en AE en el grupo PO, ser reducido cuando comparado a los animales de 6M bajo el mismo régimen masticatorio. Aunque no haya una explicación conclusiva para ese hecho, se sugiere que, como el factor neurotrófico BDNF (brain derived neurotrophic factor) contribuye para la regulación de la astrogénesis, los niveles reducidos de BDNF, asociados al envejecimiento y a la restricción masticatoria, pueden contribuir a la disminución del número de astrocitos²⁸. En contraposición, se sugiere también que la astrocitosis, observada en el Stratum oriens a los 18M, no depende de BDNF, pero sí es parte de la respuesta inflamatoria asociada al proceso de envejecimiento²⁹. Permanecen por ser investigados, no obstante, los posibles mecanismos moleculares que tornan la astrogénesis laminar diferencialmente sensible a la restricción masticatoria o a los efectos combinados de los desequilibrios masticatorios y del envejecimiento. En ese sentido, el efecto más dramático de reducción de la astrogénesis sucedió en el Stratum pyramidale de CA1 en los animales de 12M y que se extendió a los animales de 18M, incluyendo todos los regímenes de dieta, sobre todo el MG. En todos los otros estratos de CA1, el AE mostró reducción en los cambios impuestas por el régimen masticatorio, tornando os grupos bajo diferentes regímenes de dieta indistinguibles unos de otros.

Un intenso inmunomarcado para GFAP, próximo de las arterias de la fisura hipocampal encontrada en el presente trabajo, sugirió un papel para los astrocitos de esa camada en la regulación del flujo sanguíneo cerebral de CA1 y del giro dentado. Realmente, existe evidencia de que los astrocitos están involucrados en el control neurovascular¹¹. Por el hecho de que los astrocitos contribuyen al flujo sanguíneo local en el hipocampo, se documentó una reducción del inmunomarcado para GFAP en los animales viejos, independiente del régimen de dieta impuesto, siendo posible predecir que el flujo sanguíneo hipocampal puede estar alterado a los 18M. Esa disminución en el inmunomarcado para GFAP puede ser secundaria a una reducción de la actividad neural inducida por la edad en la vía de proyección temporoamónica del ratón^30,31. No obstante, como la atrofia astrocítica en los animales sometidos a la MG se mostró más severa que la observada en los animales con PE, una interpretación alternativa es que el envejecimiento y la MG pueden contribuir para el agravamiento de la reducción del flujo sanguíneo. Como no se realizó una correlación entre la densidad de los procesos inmunomarcados para GFAP y la función astrocítica, ese tema importante permanece por ser investigado.

Considerando los animales criados en AE y todas sus camadas de CA1, no se encontró diferencia entre los grupos AE/PE vs. AE/MG en las tres ventanas temporales. En contraste con ese resultado, los

animales del AP mostraron diferencias significativas en esas comparaciones. Además, a los 6M, sobre todo en el grupo AE/MG, lo que se vio en todas las camadas, fue una cantidad de astrocitos superior al grupo AP/MG. El enriquecimiento ambiental, asociado ahora al envejecimiento, no consiguió detener la reducción de la cantidad de astrocitos, ya que los grupos AE/MG de 12M y 18M no se distinguieron de los grupos AE/PE de 12M y 18M.

Delante de esos resultados, se sugiere que la astrocitosis a los 6M reuniría un mayor número de astrocitos con propiedades neuroprotectoras, y la privación masticatoria, en esa edad, impediría que el astrocito ofrezca el soporte estructural necesario a las neuronas para el desempeño de las funciones cerebrales normales³².

Se piensa también en la posibilidad de que la cantidad de astrocitos en el envejecimiento esté relacionada a mecanismos proinflamatorios, y, por lo tanto, cuando el envejecimiento esté asociado a una condición de privación masticatoria, la interacción redundará en disminución de funciones cognitivas. Almeida et al¹⁶, al someter ratones viejos de AP a pruebas de memoria espacial, concluyeron que los animales no privados de la actividad masticatoria presentaron mejor desempeño que los privados, y, al extender su análisis a ratones jóvenes y adultos, obtuvieron los mismos resultados; Mendes³³ identificó la posibilidad de que la masticación imprimiera un efecto positivo sobre el funcionamiento hipocampal, destacando, así, la importancia de adoptar medidas que eviten la reducción de la actividad masticatoria, o, aún, de promover la rehabilitación de la misma; siendo todas esas alternativas de bajo costo para retardar o recuperar déficits cognitivos no deseables.

Como un todo, los resultados sugieren que una disminución en la actividad masticatoria y el envejecimiento puedan estar interactuando y contribuyendo para promover efectos laminares diferenciales en la astrogénesis de CA1, y que el AE parece minimizar los efectos de la diferencia en la actividad masticatoria, que además están bajo las influencias del envejecimiento.

CONCLUSIÓN

El análisis cuantitativo estereológico de la distribución laminar de los astrocitos de CA1, empleando el fraccionador óptico, reveló que alteraciones masticatorias impuestas por el régimen MG afectan el número de astrocitos de forma distinta en las diferentes camadas, sugiriendo ser un hecho dependiente de la edad.

Con excepción del Stratum pyramidale de CA1, el AE muestra contraponerse a las alteraciones laminares impuestas por el régimen de reducción masticatoria y envejecimiento a todos los otros estratos.