INTRODUCCIÓN

Cepas de Escherichia coli colonizan el tracto gastrointestinal de humanos y animales unas pocas horas después del nacimiento y son el principal miembro anaeróbico facultativo de la microbiota intestinal de estos organismos¹. Esta especie, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, raramente causa enfermedad en sus huéspedes. A pesar de su papel como comensales, algunas cepas de E. coli son capaces de causar una variedad de enfermedades debido a la adquisición de factores de virulencia por transferencia horizontal¹. Entre estas enfermedades, la diarrea es una de las principales, siendo las E. coli diarrogénicas (ECD) responsables de numerosos brotes de diarrea registrados en el mundo².

Actualmente se conocen seis patotipos de ECD: E. coli enteroinvasiva (EIEC); E. coli enterotoxigénica (ETEC); E. coli enteropatógena (EPEC), subdividida en EPEC típica (tEPEC) y EPEC atípica (aEPEC); E. coli productora de toxina de Shiga (STEC), y su subgrupo E. coli enterohemorrágica (EHEC); E. coli enteroagregativa (EAEC); y E. coli de adherencia difusa (DAEC)¹. Entre estos patotipos, las cepas EPEC se destacan como un importante agente diarrogénico presente en los países en desarrollo².

Recientemente, una nueva clasificación fue propuesta por Clements et al.³, en la cual las E. coli se dividen en ocho patotipos: los seis anteriormente descritos, más E. coli adherente invasiva (AIEC), asociada a la enfermedad de Crohn ; y E. coli enteroagregativa productora de la toxina Shiga (STEAEC), responsable de un gran brote diarreico en 2011 en Europa.

Las EPEC pueden definirse por la presencia del gen eae, que codifica una proteína denominada intimina, que se requiere para la adhesión a la mucosa intestinal, produciendo una lesión de tipo attaching and effacing (A/E). Esta lesión se inicia por la adhesión de la bacteria a los enterocitos, llevando a la pérdida de las microvellosidades intestinales. La intimina es altamente variable entre los diferentes serotipos de EPEC, y algunas variantes antigénicas distintas han sido identificadas como α, β, γ, δ, ε, ι, κ, η, ζ, entre otras⁴. Las EPEC pueden clasificarse en típicas y atípicas. Los linajes que poseen el plásmido EAF (EPEC adherence factor) se llaman tEPEC y los que no poseen se llaman aEPEP. El gen bfp contenido en el plásmido EAF codifica un factor de adhesión denominado bundle-forming pili (BFP), siendo que el plásmido EAF también posee genes necesarios para la expresión de la intimina².

Las cepas aEPEC pertenecen a un grupo diarrogénico que ha aumentado mucho su frecuencia en Brasil en los últimos años. En algunas regiones del país, estas bacterias parecen haber sustituido a las tEPEC como principal agente diarrogénico. Esto indica que, en Brasil, así como ocurrió en países desarrollados, está habiendo un cambio en el perfil epidemiológico de las EPEC de típicas para atípicas^3,5.

Las cepas tEPEC raramente son aisladas de animales, siendo el hombre su principal reservorio

natural⁶. En contraste, las cepas aEPEC son aisladas de humanos y animales, con o sin diarrea, en frecuencias equivalentes, lo que no permite la definición de un depósito para esas bacterias^7,8.

Diversos estudios asocian animales domésticos, de cría y algunos silvestres como posibles reservorios y fuente de infección de aEPEC para humanos⁹. A pesar de ello, ninguno comparó, de forma amplia, muestras aisladas de humanos y animales por técnicas de biología molecular, como la secuenciación, para comprobar tales hipótesis.

Orígenes clonales comunes entre cepas bacterianas aisladas de animales y humanos pueden identificar fuentes de infección y reservorios animales de diferentes patógenos. Las muestras de ECD, para los animales y para el hombre, la mayoría de las veces, poseen factores de virulencia similares, codificados por genes de origen cromosómico o plasmídico, cuyas similitudes o diferencias pueden explicar aspectos filogenéticos y patógenos de ciertos grupos de E. coli para humanos.

El análisis epidemiológico molecular de cepas bacterianas procedentes de diferentes orígenes es una evaluación de las relaciones de parentesco existentes entre ellas. La principal cuestión de estos análisis es si diferentes aislados de un determinado patógeno representan la diseminación de un organismo común o clon. En este sentido, la epidemiología ha buscado desarrollar técnicas que proporcionen una mejor evaluación de las relaciones existentes entre diferentes aislados bacterianos.

El concepto básico de las técnicas de tipificación molecular propone que muestras bacterianas, epidemiológicamente relacionadas, poseen un precursor común; de esta forma, estudios utilizando esas técnicas permiten una mejor comprensión sobre los mecanismos evolutivos, sobre el surgimiento de cepas virulentas y reservorios de cepas bacterianas¹⁰. Frente a lo expuesto, debido a los posibles riesgos para la salud pública traído por linajes de EPEC, se necesitan estudios que evalúen la distribución y la frecuencia de estas cepas en los animales, permitiendo la comparación con cepas de EPEC aisladas de humanos.

MATERIALES Y MÉTODOS

OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS

Se obtuvieron muestras fecales o porciones de los intestinos delgados y gruesos, linfáticos y mesentéricos y fragmentos de hígado y bazo de 630 animales silvestres (roedores, aves y marsupiales) de ambos sexos, capturados en tres municipios del estado de Pará (Marabá, Parauapebas y Canãa dos Carajás), de marzo de 2008 a diciembre de 2009 (Figura 1). Los especímenes fecales recogidos fueron acondicionados en medio de transporte Cary Blair y, junto con el pool de órganos mantenidos bajo refrigeración, encaminados directamente al Laboratorio de Enteroinfecciones Bacterianas del Instituto Evandro Chagas (IEC), en donde fueron procesadas.

Figura 1 - Localización de los municipios de Parauapebas, Marabá y Canaã dos Carajás, Estado de Pará, Brasil 

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Instituto Brasileño del Medio Ambiente y de los Recursos Naturales Renovables, proceso nº 02018001038/08-11.

RESULTADOS

De los 630 cultivos analizados, heces y agrupación de órganos, se aislaron E. coli en 263 (41,7%) muestras (Tabla 2). Después de la PCR, se observó la amplificación para el gen eae en 3,04% (8/263), distribuidos en roedores con 2,66% (7/263) y marsupiales con 0,4% (1/263) (Tabla 3; Figura 2).

Figura 2 - PCR Multiplex: 1- ladder 1 Kb; 2- control positivo (cinco categorías de DEC); 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12- aEPEC; y 13- control negativo (E. coli K12 DH5) 

Después de la PCR y la secuenciación del gen eae, las muestras fueron alineadas por el programa BioEdit v7.1.3¹⁵ con las mutaciones descritas en la Tabla 4. Se observaron tasas de transición/transversión (R) igual a 7.47, según modelo de Kimura²⁰ 2-parámetros. El análisis de la prueba de Tajima's Neutrality demostró una diversidad nucleotídica (π) de 0.014298 para un número de segregaciones por sitio igual a 24 en los 917pb del gen eae de las ocho muestras analizadas. Después de analizar las secuencias del gen eae de las aEPEC de los ocho aislados de origen animal, se observó la presencia de cuatro variantes distintas para la intimina, que fueron β1 (muestras 574, 812 y 813), β2 (muestra 630), ζ (muestras 445 Y 447) y ε (muestras 611 y 856).

Después del análisis filogenético por el método de agrupamiento de pares no ponderados con base en la media aritmética (unweighted pair group method with arithmetic mean - UPGMA), el árbol consenso presentó la formación de dos grupos, compuestos de dos ramas distintas cada uno, agrupando, en el primer grupo, KT591282.1, ε1 intimina (611 y 856) con KT591233.1, β1 intimina (574, 812 y 813); y en el segundo grupo, KT591325.1, ζ intimina (445 y 447) con KT591333.1, β2 intimina (630) (Figura 3).

Figura 3 - Árbol filogenético del gen eae por el método UPGMA con 2.000 réplicas de bootstrap 

DISCUSIÓN

Los marcadores de virulencia analizados revelaron que las aEPEC aisladas poseen características genéticas similares a las encontradas en humanos con las secuencias del gen eae y se conservan en las muestras 445, 447 y 630, provenientes de aislados de roedores. Estudios anteriores demostraron la presencia de animales como reservorio de cepas consideradas como potenciales agentes de enfermedades que pueden ser transmitidas entre seres humanos y animales^21,22,23.

Estudios con aEPEC se han centrado principalmente en la comparación entre cepas aisladas de casos diarreicos y de pacientes saludables^24,25,26. Más recientemente, la identificación de la presencia de tipos de EPEC potencialmente patógenos para humanos, aislados de animales, puede indicar que la transmisión de estos microorganismos entre animales y seres humanos ocurre y tiene impacto sobre la salud pública⁶; pero poco se ha evaluado acerca de la ocurrencia de estos patógenos en animales silvestres. De esta forma, el presente estudio buscó la identificación de las subclases de intiminas en animales silvestres y observó la ocurrencia de las subclases ζ, β1, β2 y ε, como las que están circulando en ellos. Como estas subclases ya se han descrito en seres humanos y animales de cría^6,24,25,26, los datos pueden apuntar a una posible contaminación de la fauna silvestre por cepas provenientes de la contaminación ambiental o que esos especímenes están sirviendo de reservorios naturales para ese patógeno.

Entre los animales estudiados, los roedores presentaron mayor frecuencia de aEPEC, con muestras presentando secuencias altamente conservadas para el gen eae, cuando comparadas a aislados humanos⁶. Sólo un marsupial fue identificado como portador de la aEPEC, pero la secuencia aislada presentó un 100% de similitud con las observadas en roedores. La gran diversidad genómica de E. coli le confiere una notable plasticidad ecológica; gracias a ella, estos microorganismos se adaptan rápidamente a diferentes ambientes, pudiendo así pasar de organismo de vida libre a comensal del tracto intestinal de los animales de sangre caliente y, aún, a patógenos que infectan a humanos y a animales^{6,9,25,27,28,29,30}.

Xu et al.⁶, al analizar las subclases de intiminas en humanos, animales y alimentos, identificaron las intiminas λ, β2, μ, ι2, ξ, ζ, α2 y π en pacientes diarreicos. La subclase γ1 se identificó concomitantemente en pacientes diarreicos y en cerdos; la intimina κ, identificada tanto en alimentos (carne cruda) como en pacientes diarreicos; y las clases ε2, η2 y ι1, tanto en pacientes diarreicos y asintomáticos, demostrando la gran variabilidad y distribución de las aEPEC entre las muestras analizadas. Anteriormente, Moura et al.³¹ describieron el subtipo β1 como el más frecuente en aislados de animales y humanos; en ese mismo sentido, Aidar-Ugrinovich et al.²² ya habían descrito que, en Brasil, el subtipo β1 se presentaba como el más frecuente en EPEC aisladas de bovinos; similar a lo observado por Cortés et al.³², que identificaron el subtipo β1 como el más prevalente en las cepas aisladas de ovinos, seguido del subtipo γ2. En el presente estudio, los subtipos más frecuentes fueron β1 (muestras 574, 812 y 813), β2 (muestra 630), ζ (muestras 445 y 447) y ε (muestras 611 y 856), presentes en ocho aEPEC de las 263 E. coli Identificadas. Sin embargo, como no se aislaron tEPEC, y 255 muestras fueron caracterizadas como no diarreicas, se sugiere que la variabilidad existente puede ser mayor, como se observa en la literatura, reforzando la necesidad de más estudios que aclaren la variabilidad genética existente entre las EPEC aisladas de humanos y animales en la Región Amazónica.

CONCLUSIÓN

Los datos demostraron que las aEPEC aisladas de los animales silvestres poseen características genéticas semejantes y mostraron proximidad con el gen eae de aEPEC encontradas en humanos y en animales de cría, posibilitando inferir que los animales evaluados sirven como posibles reservorios de cepas de origen humano, bien como ser potenciales transmisores de cepas animales con carácter zoonótico.