INTRODUÇÃO
A tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa bacteriana que afeta principalmente os pulmões (tuberculose pulmonar) e pode também acometer outros órgãos (tuberculose extrapulmonar) ou, ainda, ocorrer de forma disseminada1.
A incidência da doença está em queda no mundo; no entanto, ainda é motivo de muitos óbitos em todos os continentes, com enfoque nas regiões africanas, devido aos altos índices de pacientes com vírus da imunodeficiência adquirida (HIV)2.
Desde a década de 1990, a TB é considerada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) uma emergência mundial. Metas globais foram estabelecidas para o seu controle, visando sua incidência, prevalência e mortalidade. Essas metas estão inseridas dentre os Objetivos do Desenvolvimento do Milênio, assim como na Stop TB Partnership e na Assembleia Mundial da Saúde. Esperava-se que, até o fim de 2015, ocorresse a redução pela metade das taxas de incidência e prevalência em relação aos dados de 1990; e que, até 2050, a incidência global seja menor que 1/1.000.000 de habitantes por ano3,4.
Várias espécies do gênero Mycobacterium atuam como agentes etiológicos da doença, sendo as espécies pertencentes ao complexo Mycobacterium tuberculosis (MTB) as principais associadas à TB em humanos e outros mamíferos1.
O diagnóstico presuntivo da TB é obtido por meio de achados clínicos e exames radiológicos, sendo o caso confirmado a partir da realização dos exames laboratoriais estabelecidos pelo Ministério da Saúde (MS), como a baciloscopia e a cultura. Esses métodos apresentam limitações, como a baixa sensibilidade da baciloscopia e a demora no resultado da cultura devido à multiplicação lenta do bacilo. Atualmente, a cultura é considerada padrão-ouro para o diagnóstico da TB5.
As técnicas de biologia molecular têm permitido resultados seguros e precoces. Os métodos de reação em cadeia da polimerase (PCR) apresentam uma sensibilidade em torno de 50% e especificidade de cerca de 100%, porém colidem com certos obstáculos, como a necessidade de conhecimentos técnicos avançados, recursos humanos qualificados, gastos financeiros altos e fácil contaminação2.
Recentemente, uma técnica de PCR fechada foi desenvolvida e está implantada em laboratórios de referência em vários países, inclusive no Brasil, o GeneXpert MTB/RIF (Cepheid), usado como uma ferramenta rápida para o diagnóstico da TB6. O teste realiza a purificação, concentração e amplificação de ácidos nucleicos em tempo real por meio da PCR; os processos de preparação da amostra, amplificação e detecção ocorrem de forma automatizada, que é o seu principal benefício5.
Em março de 2013, o Teste Rápido Molecular para Tuberculose (TRM-TB) foi submetido à Comissão Nacional de Incorporação de Tecnologia (CONITEC/MS) e incluído no Sistema Único de Saúde (SUS) do Brasil. Após, 127 laboratórios de 92 municípios foram selecionados para receber o método molecular na primeira fase de implantação. Esses municípios compõem a Rede de Teste Rápido para Tuberculose e foram selecionados com base nos seguintes critérios: alta taxa da doença em 2012, população indígena, população privada de liberdade, municípios de fronteiras e capitais. Anteriormente, um estudo piloto fora realizado nas cidades do Rio de Janeiro e Manaus, tendo demonstrado que o TRM-TB aumentou a detecção de casos em 43% em relação à baciloscopia, com sensibilidade de 90% e especificidade de 99%4.
O método GeneXpert MTB/RIF, ao mesmo tempo em que identifica o complexo MTB a partir da sequência específica do gene rpoB na região 81bp, também verifica a resistência à rifampicina (RIF) por meio das mutações do gene. O ensaio GeneXpert é composto de um cartucho plástico para o processamento das amostras líquidas, contendo tampões e reagentes liofilizados de PCR, uma máquina automática e um sistema de software, que analisa amostras respiratórias em 2 h. O método apresenta um limite de detecção em torno de 131 UFC/mL da amostra2,7.
O GeneXpert foi projetado para ter riscos biológicos mínimos, sendo substancialmente menores do que os apresentados na microscopia, já que a única etapa manual é a preparação da mistura de um tampão bactericida com uma amostra, e essa mistura é adicionada ao cartucho8,9. Diferentemente dos outros ensaios de PCR em tempo real, o GeneXpert é uma técnica simples, que pode ser realizada com treinamento pessoal mínimo e fornece resultados em um curto período10,11,12.
O teste está preconizado para o diagnóstico dos casos de TB e para pacientes com suspeita de multirresistência ou portadores do HIV. Por ser um método sensível que utiliza PCR, não é indicado para pacientes que já tiveram a TB, pois esses indivíduos ainda podem apresentar resíduos de DNA do bacilo, que podem ser captados pelo sistema GeneXpert, resultando em um falso-positivo13.
Mutações silenciosas, aquelas que não alteram as propriedades das proteínas codificadas, podem ser captadas como mutações específicas no gene rpoB pelo GeneXpert, originando um resultado falso-positivo. Dessa forma, a OMS recomenda repetir o teste em outra amostra do paciente. Assim, o tratamento deve ser iniciado após o teste molecular detectar repetidamente a resistência14,15.
As pesquisas e estudos sobre métodos de diagnósticos são importantes no âmbito científico para facilitar e acelerar o descobrimento da doença e, consequentemente, o seu tratamento, aumentando as chances de cura dos pacientes. Dessa forma, buscou-se, por meio de uma revisão de literatura nacional e internacional, analisar os resultados da utilização da metodologia de diagnóstico para TB, GeneXpert, uma vez que foi recentemente implantada em nível mundial e no SUS com a proposta de ser uma ferramenta precisa, específica e rápida quando comparada a outros métodos.
METODOLOGIA
Realizou-se um levantamento de informações acerca do método GeneXpert, utilizando uma pesquisa exploratória e de caráter bibliográfico. Trata-se de uma revisão da literatura nacional e internacional relacionada a essa metodologia para o diagnóstico da TB.
Para essa busca, foram utilizados artigos escritos em português, espanhol e inglês, publicados no período de 2010 a 2015, indexados nas bases de dados: Medical Literature Analysis and Retrieval System Online (MEDLINE), Scientific Electronic Library Online (SciELO), Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciências da Saúde (LILACS) e Google Acadêmico. Os termos pesquisados, associados ou não, foram: tuberculose; Xpert; GeneXpert; Cepheid; Xpert MTB; Xpert MTB RIF; Cepheid Xpert; GeneXpert Tuberculosis. A maioria desses descritores, apesar de não serem encontrados nos Descritores em Ciências da Saúde (DeCS), é amplamente utilizada por pesquisadores da área e encontrada nas bases de dados.
O material foi categorizado de acordo com o ano de publicação, o periódico, o local do estudo e os resultados encontrados. Foi elaborado um protocolo para organização da análise dos artigos contendo os itens: base de dados, autores, periódico, ano, local e período do estudo, objetivo, resultados favoráveis e desfavoráveis, amostragem/população-alvo, técnica de comparação, especificidade, sensibilidade, conclusões favoráveis e desfavoráveis e idioma do artigo. Foram incluídos artigos originais com abordagem quantitativa e/ou de revisão, e excluídos os artigos que não estavam relacionados ao tema deste estudo, bem como os publicados fora do período analisado.
A busca resultou em 75 artigos. Na base LILACS, foram encontrados seis trabalhos e, desses, dois foram excluídos por serem de reflexão e revisão; na MEDLINE, encontraram-se 47 artigos, sendo que um não entrou para análise por não abordar diretamente o tema, um por ser revisão e quatro foram excluídos por terem a abordagem metodológica diferente do objetivo desta revisão; na SciELO, a busca resultou em oito, sendo três excluídos, um por se tratar de uma abordagem da TB sem resultados diretos sobre o GeneXpert, um por ser artigo de revisão e outro por ter a metodologia divergente do objetivo desta revisão; e, no Google Acadêmico, 11 foram encontrados, sendo excluídos um artigo em francês, um por não abordar diretamente o GeneXpert e dois por serem artigos de revisão. Além disso, foram utilizados dois artigos retirados das bases de dados do Ministério da Saúde e um relatório da OMS para a pesquisa de dados estatísticos. Desse modo, foram analisados 60 artigos neste estudo.
Para a apresentação da síntese de alguns dos dados encontrados, optou-se pela criação de quadros que indicam o artigo analisado, a especificidade e a sensibilidade encontradas no método GeneXpert, a técnica que o autor utilizou para comparação e a amostragem. Esses dados foram apresentados de acordo com os tipos de amostras utilizadas pelos autores: amostras extrapulmonares e pulmonares, amostras exclusivamente extrapulmonares ou pulmonares. As principais conclusões desses artigos, com o respectivo local de estudo, foram apresentadas em quadro separado.
RESULTADOS
Dos 60 artigos analisados, 11 (18,3%) entraram para os itens introdução e discussão, pois abordaram a TB e/ou o GeneXpert em um contexto geral.
Dos 49 artigos que utilizaram amostras clínicas, 25 (51,0%) foram provenientes de países considerados prioritários para TB, e 24 (49,0%) foram de países com incidência relativamente baixa como EUA, Espanha, Grécia, Itália, França, Canadá, Suíça, Alemanha, Polônia, entre outros.
Nos artigos que utilizaram amostras clínicas (N = 49), a TB pulmonar foi a mais relatada, representando 63,2% (N = 31). A TB extrapulmonar foi objeto de estudo em 14,3% (N = 7) dos artigos e 22,5% (N = 11) estudaram amostras extrapulmonares e pulmonares.
Nos artigos avaliados nesta revisão, o menor valor de sensibilidade encontrado para o método GeneXpert foi de 46,0%16 e o maior, de 100%10,13,17,18 para a detecção do bacilo.
No quadro 1, são apresentados estudos com amostras pulmonares e extrapulmonares.
A seguir, no quadro 2, são apresentados estudos que utilizaram somente amostras pulmonares.
No quadro 3, são apresentados estudos que utilizaram somente amostras extrapulmonares.
No quadro 4, são listadas as principais conclusões acerca do método GeneXpert em estudos incluídos nesta revisão.
DISCUSSÃO
O teste molecular rápido GeneXpert é uma técnica consideravelmente nova e encontra-se em fase de implantação em muitos países, uma vez que a comunidade global se mobilizou rapidamente para usar essa nova tecnologia, com vistas a melhorar o diagnóstico da TB. Esse método ainda é questionado sobre o seu desempenho para diagnosticar a doença e a resistência à RIF, principalmente quando é confrontado com baciloscopia, cultura e teste de sensibilidade aos antibióticos (TSA), que são técnicas comumente empregadas na identificação da TB e da resistência aos medicamentos. Devido a isso, estudos estão sendo realizados em nível mundial para avaliar a acurácia do GeneXpert e os resultados de sua implantação.
Os artigos encontrados apontaram bom desempenho do método molecular GeneXpert no diagnóstico da TB, porém os valores de sensibilidade para a detecção do bacilo variaram entre os diversos autores10,13,16,17,18. A cultura e a baciloscopia foram as técnicas mais empregadas na comparação ou na confirmação dos resultados obtidos por meio do GeneXpert. Outras técnicas moleculares, como o LightCycler® Mycobacterium Detection (LCTB), IS6110 TaqMan, Gen-Probe's, Genotype MDRTB-plus, IS6110 LDT (laboratory-developed test), Cobas TaqMan MTB e ProbeTec ET-DTB, foram utilizadas para comparar a atuação do GeneXpert.
Quando comparado a outra metodologia molecular, no estudo de Miller et al.21, foi observada uma diferença nos desempenhos do GeneXpert MTB/RIF com o ensaio LDT IS6110 PCR para amostras de cultura positiva. O IS6110 LDT detectou apenas 22% das amostras, enquanto o GeneXpert MTB/RIF detectou 67%. No estudo de Park et al.29, o GeneXpert foi ligeiramente melhor do que o ensaio molecular Cobas TaqMan MTB na identificação do bacilo em amostras com baciloscopia negativa; porém a técnica de comparação superou o GeneXpert nas análises de amostras com baciloscopia positiva. Os autores ainda relataram que o ensaio Cobas, ao contrário do GeneXpert, requer a descontaminação e concentração das amostras, aumentando, assim, o tempo de execução dessa técnica.
Antonenka et al.33 compararam o GeneXpert com outras duas técnicas moleculares, o Cobas TaqMan MTB e o ProbeTec ET-DTB, avaliando o desempenho e o tempo de processamento das técnicas. O ProbeTec obteve melhor sensibilidade e o Cobas melhor especificidade, superando assim o GeneXpert, que apresentou dois resultados falso-positivos; porém o GeneXpert alcançou maior desempenho em relação ao Cobas na detecção do complexo MTB em amostras com cultura e baciloscopia positivas. Entre os pontos positivos do GeneXpert relatados nesse estudo, está o fato de que essa metodologia pode ser empregada em laboratórios que dispõem de pouco pessoal treinado e possuem restrições de recursos e tecnologia33.
Embora a maioria dos artigos tenha reportado amostras pulmonares, alguns estudos mostraram boa performance do método GeneXpert em amostras extrapulmonares2,10,13,23,31, mas Rufai et al.32 não apontaram boa eficácia do mesmo em amostras de fluido pleural. Em pesquisa desenvolvida por Rzechorzek et al.34, na qual foram analisadas biópsias de 23 pacientes, o GeneXpert identificou o bacilo em uma das amostras, sendo que esse resultado foi concordante com os exames histopatológicos. Embora o estudo tenha utilizado poucas amostras, os autores destacaram o fato do GeneXpert não ter originado nenhum resultado inválido.
De acordo com Maynard-Smith et al.35, o desempenho do GeneXpert em amostras extrapulmonares ainda não é claro, e estudos seriam necessários para expandir a base de evidências do uso do ensaio molecular para o diagnóstico da TB extrapulmonar em diferentes contextos epidemiológicos; entretanto, os dados atuais já fornecem o suporte para a implementação desse método em amostras extrapulmonares.
A análise de amostras sanguíneas pelo GeneXpert mostrou ser possível em um estudo que utilizou uma solução tampão de lise para o processamento das amostras, removendo possíveis substâncias inibidoras da PCR e melhorando, assim, o desempenho do método36. Em uma pesquisa que utilizou amostras pulmonares e extrapulmonares, congeladas por um período de 10 anos, com baciloscopia negativa, a sensibilidade ficou um pouco abaixo de outros estudos com amostras não congeladas37. A incubação das amostras durante certo período pode influenciar a análise do GeneXpert; amostras incubadas por até 72 h não interferiram na detecção da doença, porém a incubação por um tempo superior a 24 h pode originar resultados falso-resistentes à RIF38.
Os países pertencentes à lista de prioridade da TB, segundo a OMS, foram objetos de estudo em 51,1% dos artigos pesquisados. Para desenvolver um aparelho como o GeneXpert, são necessários investimentos e alta tecnologia, e os países não prioritários para a doença têm interesse em pesquisar sua eficácia; mas, de fato, a sua aplicação se dá em países em desenvolvimento, que detêm uma carga elevada da doença. Dorman et al.39 observaram que as características de desempenho do GeneXpert podem ser diferentes quando o mesmo é implementado em um cenário em que poucas pessoas têm a doença, como nos EUA, comparado a quando aplicado para a detecção passiva em países de alta carga da doença.
O GeneXpert foi desenvolvido com o intuito de substituir a baciloscopia. Nos estudos realizados por Iram et al.18 e Tortoli et al.30, foi constatado que esse método molecular atingiu melhores resultados, podendo substituí-la. Entretanto, Balcha et al.24 e Weyer et al.40 sugeriram que o GeneXpert seja utilizado de forma adjunta à baciloscopia. Habib et al.41 relataram que, em pacientes grávidas, o GeneXpert obteve melhor sensibilidade, detectando a doença com maior rapidez, com destaque para os casos com baciloscopia negativa.
Weyer et al.40 afirmaram que o desempenho do GeneXpert é bastante favorável para populações vulneráveis que necessitam de tratamento enquanto aguardam os resultados convencionais. Na África do Sul, um estudo sugeriu a ampliação da utilização do GeneXpert como um substituto para a baciloscopia em países com alta carga de TB e, principalmente, para populações especiais, como crianças e adultos vivendo com HIV, população indígena e encarcerados42. Nduba et al.43 sugeriram ainda a metodologia GeneXpert para implementação do diagnóstico em adolescentes com baciloscopia negativa, uma vez que a detecção pelo exame direto é baixa nessa população e a prevalência de TB é elevada, com a maioria dos casos não detectados rotineiramente. Anderson et al.44, relataram a alta especificidade do GeneXpert na detecção da TB infantil, porém a sensibilidade do ensaio nessa faixa etária foi limitada.
De acordo com Muyoyeta et al.45, a recomendação da OMS para o uso do GeneXpert para pacientes HIV positivos suscita problemas éticos e de recursos. Pacientes com baciloscopia negativa que não têm HIV associado devem também ser considerados para teste com o GeneXpert, o que pode evitar atrasos no diagnóstico e a contínua transmissão da doença a partir desses doentes. No entanto, a viabilidade de tal estratégia exigiria enormes recursos para testar um grande número de pacientes sem associação com o HIV e com baciloscopia negativa.
O ensaio molecular demonstrou bom desempenho na detecção do bacilo em amostras com baciloscopia negativa8,21,25, porém Rachow et al.28 apontaram a necessidade de mais estudos para averiguar a ação do GeneXpert em esfregaços negativos.
A técnica é considerada simples, exigindo treinamento pessoal mínimo e o seu custo é equivalente a outras técnicas moleculares. Muitos estudos relataram a rapidez e simplicidade do método37,39,46,47,48, o início do tratamento precoce45,49,50,51, a diminuição do número de contaminações cruzadas52, o aumento do número de casos positivos não detectados por baciloscopia ou cultura18,37 e se tratar de um método sensível e específico53,54. Além disso, ao contrário da baciloscopia, as etapas de pipetagem manual e a parte automatizada do ensaio não geram aerossóis viáveis, resultando em riscos biológicos mínimos20,22; e o desempenho do teste pode ser menos dependente da habilidade do usuário, motivação ou carga de trabalho da baciloscopia11. Banada et al.38 avaliaram os riscos biológicos do GeneXpert e, segundo os autores, o sistema fechado, automatizado e os cartuchos reduzem os riscos de formação de aerossóis viáveis, fazendo desse método a ferramenta ideal para os laboratórios que não dispõem de instalações de segurança biológica.
No estudo de Dorman et al.39, o número de testes falso-positivos do GeneXpert foi baixo e, quando comparado com a cultura por MGIT, sua sensibilidade foi menor. No entanto, os autores concluíram que a facilidade de uso do GeneXpert pode ser um ganho. De fato, a cultura líquida continua a ser o padrão-ouro para o diagnóstico de TB. Métodos moleculares atuais também não são ainda capazes de suplantar a cultura e o TSA55.
Durante o tratamento, o paciente deve ser monitorado com testes convencionais, uma vez que a metodologia do GeneXpert não é indicada para o controle de tratamento, pois o teste detecta DNA de bacilos viáveis e não viáveis, sendo esse um dos pontos negativos do GeneXpert13,40.
O ensaio ainda pode detectar mutações silenciosas, que não conferem resistência à RIF, sendo também um resultado falso-positivo, o que reforça as recomendações da OMS para a confirmação dos casos de RIF resistente por métodos genotípicos e/ou fenotípicos14,15. Somoskovi et al.56 salientaram que o diagnóstico da multirresistência não pode ser baseado em um único teste, mas deve ser sempre estabelecido por uma avaliação e verificação completa de todos os dados clínicos e laboratoriais.
Outro fato é que o GeneXpert precisa de alguns requisitos para sua instalação, como um ambiente com fonte estável de energia elétrica e temperatura entre 2-28 °C, para garantir o bom funcionamento do equipamento e a estabilidade dos cartuchos e reagentes57. Dentre outros pontos citados como desfavoráveis, podem ser observados: o custo, que impossibilita, por muitas vezes, a repetição dos testes37,57,58,59; a detecção de falso-positivos e falso-negativos durante o estudo49; o número de erros e resultados inválidos; as amostras com volume insuficiente (menos de 1 mL); e as amostras que apresentam vestígios de sangue pesados ou resíduos de alimentos e têm que ser examinadas por baciloscopia46.
Para a detecção de resistência à RIF, o GeneXpert tem apresentado bom desempenho26, fornecendo resultados precisos, que permitem o início rápido do tratamento, enquanto são aguardados os resultados de cultura e TSA53. Marlowe et al.7, Scott et al.27 e McAlister et al.14 obtiveram resultados falso-positivos na detecção da resistência à RIF pelo método GeneXpert, apontando as mutações silenciosas como as causadoras desses resultados. Sohn et al.16 e Zeka et al.19 apontaram a necessidade de confirmar os resultados do GeneXpert com a cultura e o TSA. Weyer et al.40 sugeriram o teste GeneXpert para indivíduos em risco de resistência a drogas e relataram que deve ser utilizado como teste de diagnóstico inicial, uma vez que, comparado com o TSA convencional, o GeneXpert identificou corretamente 97,6% dos pacientes com cepas resistentes à RIF e 98,1% daquelas sensíveis à RIF.
Diversos estudos mostraram-se cautelosos em relação ao custo da tecnologia60, infraestrutura existente e ao desafio de resultados falso-positivos para resistência à RIF. Em contrapartida, os métodos convencionais também apresentam limitações, uma vez que não há método perfeito para o diagnóstico da TB40. Dessa forma, inovações em tecnologia podem contribuir para que a eliminação da TB seja viável nos próximos anos, e as políticas devem avaliar os benefícios para o paciente e para a saúde pública, combinando os métodos já existentes com as novas metodologias na atenção ao doente com TB57.
De modo geral, as conclusões dos artigos levantados apontaram fatores positivos do método, como a eficiência do teste no diagnóstico da TB, a simples execução da técnica, requerendo pouco treinamento pessoal, o baixo risco de acidentes e contaminação, a rapidez dos resultados, além do custo similar ao de outras técnicas que utilizam PCR.
Por meio do levantamento dos artigos relacionados ao GeneXpert, é evidente a carência de mais estudos acerca desse método, principalmente utilizando amostras extrapulmonares. Trabalhos adicionais podem esclarecer alguns pontos, como a superioridade do GeneXpert sobre a baciloscopia e o seu uso em amostras extrapulmonares, já que os estudos citados apresentaram divergências entre si em relação a esses pontos.
CONCLUSÃO
Para a identificação precoce dos casos de TB, um rápido e eficaz diagnóstico se faz necessário. Para isso, técnicas específicas, com alta sensibilidade e realizadas em um curto período devem ser empregadas. O GeneXpert MTB/RIF é o mais novo método preconizado pelo MS, sendo proposto para substituir a baciloscopia; entretanto, por critério prévio, apenas alguns municípios brasileiros dispõem dessa metodologia.
Entre os pontos positivos do GeneXpert, está a identificação simultânea do DNA do complexo MTB e de mutações relacionadas à resistência à RIF, utilizando a técnica de PCR em tempo real, integrados em um único cartucho descartável, que fornece resultados dentro de 2 h. O ensaio é composto de um sistema automatizado, sendo que a única etapa manual é o processamento da amostra com um reagente tampão, evitando, assim, os riscos relacionados à biossegurança e à contaminação das amostras e do equipamento.
O método apresenta boa sensibilidade e especificidade na identificação do bacilo, sendo uma ferramenta rápida para o diagnóstico de novos casos da doença. Em relação à resistência à RIF, poucos estudos avaliaram o desempenho do GeneXpert.
Alguns estudos concluem que o GeneXpert não elimina a necessidade de métodos bacteriológicos tradicionais (baciloscopia, cultura e TSA) e de outros métodos moleculares rápidos. Além disso, o aparelho que está disponibilizado para alguns dos municípios brasileiros tem a capacidade de realizar apenas quatro exames a cada 2 h.
Portanto, muitos pontos positivos são encontrados nesse inovador teste molecular rápido. Entretanto, a realização de mais estudos irá melhorar o entendimento acerca do GeneXpert MTB/RIF e contribuir para o diagnóstico da TB.