VETORES BASEADOS EM RETROVÍRUS

Os retrovírus são vírus envelopados, constituídos de um genoma de fita simples de RNA, de polaridade positiva, com cerca de 7 a 11 kb (kilobase)²⁰. Após a entrada na célula-alvo, o genoma de RNA é transcrito em uma fita dupla de DNA, a qual é integrada no genoma celular²². Todos os genomas retrovirais possuem dois terminais longos de repetição (LTR) nas extremidades 5' e 3' que flanqueiam os genes gag, pol e env, os quais codificam as proteínas estruturais, as transcriptases, as integrases e as proteases¹⁹.

A localização da maioria das sequências atuantes em cis (do inglês cis-acting), na região terminal desses vírus (sítio de ligação do iniciador, região polipurínica e sinais de empacotamento), tem permitido a construção de retrovetores simples e eficientes, sendo amplamente utilizados para terapia gênica²³. Nesse tipo de vetor, pode-se utilizar DNAs exógenos de até 8 kb para serem inseridos no lugar dos genes virais²⁴.

Dentre os retrovírus, um deles tem sido amplamente estudado e utilizado para a construção de retrovetores: os lentivírus. Esses vírus possuem um genoma complexo e, além dos genes gag, pol e env, codificam dois genes regulatórios, tat e rev, essenciais para a expressão do genoma, além de um conjunto de genes acessórios²². Os lentivírus apresentam um melhor perfil de segurança referente à ativação de proto-oncogenes quando comparados a outros retrovírus¹³. Estudos mostraram que os vetores lentivirais têm uma menor tendência a se integrarem ao genoma do hospedeiro em locais que potencialmente podem causar câncer²⁰.

É importante ressaltar que os vetores lentivirais apresentam comportamentos diferentes com relação às células-alvo. Em células não divisíveis, como neurônios, hepatócitos e fibras musculares, os vetores mantêm-se estáveis em uma forma não integrada ao genoma do hospedeiro. Nas células com capacidade de divisão, os vetores se integram ao genoma da célula e são duplicados com o DNA do hospedeiro, representando então um risco de oncogênese, mesmo que menor em relação a outros retrovírus²⁵.

Dentre os lentivírus, o vírus da imunodeficiência humana (HIV) é o que mais se destaca para construção de vetores. Os vetores baseados em HIV-1 foram desenvolvidos, sobretudo, com o objetivo de transduzir células não mitóticas. Outra vantagem desses vetores é a expressão prolongada nas células transduzidas²⁶.

Os vetores de HIV estão entre os sistemas de transdução considerados mais eficientes in vivo e ex vivo; contudo, devido ao potencial de patogenicidade residual dos vetores de HIV, outros vetores estão sendo pesquisados, como o vírus da imunodeficiência felina, o vírus da anemia infecciosa equina e o vírus da imunodeficiência bovina¹⁹.

A glicoproteína do envelope viral dita o tropismo das partículas virais para células de um determinado hospedeiro, pela interação com os receptores nas células-alvo. O mecanismo de montagem (empacotamento) dos retrovírus permite a construção de vetores com substituição da proteína do envelope viral pela proteína de um vírus diferente, em um processo denominado de pseudotipagem, permitindo aumentar ou mudar o tropismo celular desses vetores²⁷. Desse modo, a glicoproteína G do vírus da estomatite vesicular tem sido utilizada, por exemplo, para aumentar o tropismo de retrovetores na transdução de neurônios e células da glia^28,29. Visando redirecionar o tropismo dos retrovetores para as células epiteliais do trato respiratório, a pseudotipagem foi utilizada com a glicoproteína M2 do influenza e a proteína F do vírus Sendai, observando-se uma melhora de 5% da eficiência na transdução de células ciliadas das vias respiratórias³⁰.

Outra abordagem utilizando retrovírus tem sido a construção de vetores autoinativantes (self-inactivating - SIN). Os vetores do tipo SIN são construídos por meio da exclusão da sequência da região U3 do 3' LTR e, com isso, inativando o promotor endógeno do provírus²⁶. O sistema de autoinativação visa diminuir os riscos de uma possível replicação viral desordenada e evita a codificação de sequências celulares adjacentes ao local de integração, reduzindo o risco de oncogênese de inserção³¹. Porém, mesmo com o uso de vetores SIN e promotores reguladores, ainda há o risco da ativação de genes próximos ao local de inserção, uma vez que a integração do DNA retroviral é um processo pseudoaleatório na célula hospedeira¹⁷.

Para diminuir esse efeito, alguns estudos têm abordado o uso do isolamento do genoma em torno do local de inserção (região flanqueada). Utilizam-se isoladores, pequenos elementos de DNA, que agem como barreira impedindo que elementos promotores e modificadores da cromatina influenciem na expressão de genes vizinhos. O isolador mais pesquisado é o cHS4, derivado do locus β-globina da galinha (Gallus gallus domesticus)³.

A deficiência da adenosina desaminase (ADA) resulta no acúmulo de substâncias tóxicas de metabólitos intra e extracelulares (trifosfatos de desoxiadenosina e de adenosina), comprometendo o desenvolvimento de linfócitos T, linfócitos B e células natural killers³². Alguns estudos foram realizados utilizando vetores retrovirais para tratamento da ADA. Na década de 1980, a transferência dos genes foi realizada em células do cordão umbilical, ex vivo. A resposta foi insuficiente, devido ao reduzido número de células transduzidas³³. Em 2000, 40 pacientes oriundos da Itália, do Reino Unido e dos Estados Unidos foram submetidos à terapia, utilizando vetores retrovirais para codificar o gene G-ADA³⁴. Houve melhora do quadro de imunodeficiência e nenhum paciente desenvolveu leucemia, apenas uma pequena atividade de transcrição foi observada em clones de células T²⁶. Em um ensaio clínico francês, células CD34⁺ foram infectadas com vetor retroviral para a entrega do transgene, com resultados não satisfatórios. Três pacientes evoluiram com leucemia após dois anos do procedimento, devido à ativação do proto-oncogene LMO2³. Entre 2003 e 2004, no Japão, duas crianças desenvolveram células gene-T corrigidas, porém em quantidade insuficiente para recuperação imune³².

Vetores baseados em retrovírus também foram utilizados para tratamento da imunodeficiência combinada grave ligada ao X1 (SCID-X1). A doença é causada por uma mutação no gene IL2RG, que conduz a uma expressão deficiente da cadeia gama comum, uma subunidade compartilhada por receptores de citoquinas, incluindo interleucinas 2, 4, 7, 9, 15 e 21, que desempenham importante papel no desenvolvimento e função dos linfócitos³⁴. Os portadores da imunodeficiência apresentam desenvolvimento deficiente de células natural killers e células T, além de células B não funcionais²⁶. Em 2000, na França, 10 crianças portadoras de SCID-X1 foram submetidas à terapia gênica; no entanto, dois anos após o tratamento, duas crianças que haviam sido tratadas com altos níveis de material transgênico desenvolveram leucemia. Ficou comprovado que a inserção do vetor retroviral próximo ao promotor proto-oncogene LMO2 promoveu a expressão desordenada do referido promotor^31,33.

A doença granulomatosa crônica, que é uma doença rara, hereditária, autossômica, recessiva e que provoca uma deficiência na função dos neutrófilos, devido à mutação no sistema NADPH oxidase, também foi alvo de terapia gênica²⁶. Os dois primeiros testes realizados nos Estados Unidos, em 1995 e 1998, com um total de 10 pacientes, utilizaram vetores retrovirais. Em todos os pacientes, o número de neutrófilos corrigidos persistiu por alguns meses, todavia não resultou em benefício clínico em longo prazo³⁴. Em 2006, em um ensaio clínico franco-suíço, foram inseridas células CD34 modificadas com vetor retroviral em três pacientes, com diminuição de recidivas de infecções por dois anos. Após esse período, um dos pacientes morreu por sepse, devido à reativação da doença, o que evidenciou a diminuição da expressão do transgene³¹.

Embora amplamente utilizados, os vetores baseados em retrovírus apresentam algumas desvantagens, como o alto risco de mutagênese de inserção, a baixa estabilidade e a transdução apenas em células em divisão. Por outro lado, é preciso considerar a possibilidade de integração do genoma do vetor dentro do genoma do hospedeiro, o que pode ser importante para algumas patologias, além do fato de que é pouco imunogênico e as partículas virais podem ser produzidas em altos títulos¹⁹.

VETORES BASEADOS EM ADENOVÍRUS

O uso de adenovírus humanos (HAdV) recombinante recebeu especial atenção, como veículo para transferência de genes, quando foi utilizado para infectar células do epitélio respiratório no tratamento de doenças como a fibrose cística. Desde então, foi rapidamente observado que tais vetores seriam os mais eficientes sistemas para a transferência de genes considerando uma ampla variedade de tecidos²².

Embora existam mais de 50 diferentes sorotipos de HAdV reportados, os vetores são primariamente derivados dos sorotipos 2 e 5, os mais comuns, aos quais a maioria dos adultos tem sido exposta¹⁹.

Os adenovírus (AdV) são vírus não envelopados, com genoma de DNA de fita dupla³⁵. Durante seu processo de replicação, os genes da região precoce 1 (E1) são rapidamente transcritos e servem como reguladores transcricionais para o processo de replicação do genoma. Os genes E1 (E1A e E1B), em combinação com os genes E2 e E4, são necessários para a replicação do genoma viral. O gene E3 é um gene sem função essencial para o vírus. Tardiamente na replicação, os genes que codificam as proteínas estruturais são transcritos, permitindo o empacotamento dos genomas recém-produzidos^19,36.

Na primeira geração de vetores virais baseados em HAdV, o gene precoce E1A era deletado, inibindo a replicação viral e abrindo espaço para a inserção do transgene. No entanto, para reduzir o risco de reversão do mecanismo de replicação, o qual poderia ocorrer devido à recombinação com outros componentes do genoma viral ou celular, novos vetores passaram a ser produzidos, com deleção dos genes E1B e E3, os quais apresentam um importante papel na modulação da imunidade específica para HAdV³⁷.

Assim como todos os vetores que são incompetentes na replicação por terem tido genes essenciais para a replicação deletados, as partículas de HAdV recombinantes só poderão ser produzidas a partir das chamadas linhagens celulares de empacotamento^35,36,38. A nova geração de vetores baseados em HAdV é desprovida da maioria dos genes virais, contendo apenas os terminais de repetição e os sinais de empacotamento e sendo produzidos em células de empacotamento que expressam estavelmente a maioria dos genes virais necessários para a montagem do vírus³⁹.

Estudos iniciais focavam no uso de vetores baseados em HAdV para o trato respiratório, alvo principal da infecção por HAdV. Atualmente, com o refinamento das técnicas de engenharia genética, esses vetores são capazes de infectar uma grande variedade de células pós-mitóticas, incluindo as células presentes em tecidos altamente diferenciados, como músculo esquelético, pulmão, cérebro e coração⁴⁰.

Vetores baseados em HAdV foram utilizados na terapia gênica para a deficiência da ornitina transcarbamilase (OTC). Nessa doença ocorre um defeito no gene OTC que codifica a enzima OTC, responsável por converter a amônia, produto de excreção hepática, em ureia. O paciente evolui com hiperamonemia, provocando sintomas variados, como letargia, vômitos, convulsões, encefalopatia e cirrose. Em 1999, em um ensaio clínico utilizando vetor de HAdV, um paciente foi a óbito, devido à resposta inflamatória provocada pelo vetor. Além disso, as investigações revelaram que houve descumprimento do protocolo aprovado, sub-registro de eventos adversos e divulgação insuficiente de conflitos de interesse⁴¹.

Os vetores baseados em HAdV também têm sido desenvolvidos e estudados para o tratamento de doenças não monogênicas, como câncer^42,43,44,45, artrite reumatoide⁸ e aids²⁶.

Uma das principais desvantagens no uso desses vetores está na alta imunidade estimulada por eles, com casos já relatados de morte devido à severa resposta antivetor gerada pela excessiva inoculação do vetor. Diante disso, novos vetores, baseados em AdV derivados de vírus parentais que raramente circulam em humanos, estão sendo desenvolvidos¹⁹.

VETORES BASEADOS EM VÍRUS ADENOASSOCIADOS

O vírus adenoassociado (AAV) possui um genoma constituído por DNA linear de fita simples, com cerca de 4,7 kbp, protegido por um capsídeo icosaédrico. O genoma desse vírus é composto de dois genes: rep, replicase requerida para a replicação do genoma viral; e cap, o qual codifica proteínas estruturais. Os genes são flanqueados por duas sequências palindrômicas denominadas ITRs (repetições terminais invertidas)¹³.

Para a sua replicação, o AAV precisa da coinfecção com vírus auxiliares, como os vírus herpes simples, AdV e vírus do papiloma humano (HPV). Na falta de um vírus auxiliar, o genoma do AAV pode persistir no hospedeiro como um epissoma (unidade replicadora que atua de forma independente) e pode se integrar em local específico no genoma do hospedeiro, no cromossomo 19, sendo esse processo mediado pela proteína rep⁴⁶.

Após a reativação por infecção com um vírus auxiliar, ocorre um conjunto de eventos que conduz à produção de partículas infecciosas. Esses eventos incluem a ativação precoce do gene rep, o resgate do genoma do AAV e, finalmente, a geração de formas replicativas de DNA que também servem como modelos para a síntese de proteínas rep e cap⁴⁷.

Para desenvolver vetores baseados em AAV, os genes rep e cap são deletados e fornecidos in trans. Em vetores de AAV recombinante (rAAV), os genes virais são substituídos por um transgene que carrega o promotor, o gene de interesse e o local pA¹⁸. Inicialmente, essa função era realizada pelos adenovírus auxiliares, que possuíam os genes importantes para o empacotamento e para a replicação do AAV recombinante. No entanto, devido aos problemas de produção, no qual se tornava difícil separar o vírus auxiliar do vetor recombinante no produto final, os adenovírus foram substituídos por plasmídeos que expressam os genes ausentes^19,20,48.

Em 2004, Nathwani et al.⁴⁹ reportaram o uso de vetores de AAV para tratamento da hemofilia B ou doença de Christmas, que é hereditária, recessiva e ligada ao X, na qual ocorre deficiência do fator IX ou fator Christmas, uma das principais proteínas da cascata da coagulação⁴⁹. Apesar da existência da hemofilia A, que é decorrente da deficiência do fator VIII, as pesquisas se concentram no tipo B, pois as regiões e sequências reguladoras do fator IX podem ser facilmente codificadas no vetor viral adenoassociado⁵⁰. A hemofilia B caracteriza-se por episódios recorrentes de sangramentos. No referido estudo⁴⁹, foi realizado um ensaio clínico com 10 pacientes portadores de hemofilia B, utilizando vetores de AAV, sorotipo self-complementary 8 (AAV8), para aumentar os níveis do fator IX por um período de até 16 meses. Os resultados foram promissores, pois observou-se redução dos episódios hemorrágicos e do uso profilático de concentrados de fator IX.

Esse tipo de vetor também tem sido estudado para o tratamento da deficiência familiar da lipoproteína lipase, uma doença hereditária autossômica, recessiva, causada por mutação no gene da lipoproteína lipase (LPL), o qual codifica uma enzima produzida no tecido adiposo, no músculo esquelético e no músculo cardíaco e é responsável pelo metabolismo de lipoproteínas ricas em triglicerídeos⁵¹. Após várias pesquisas, três ensaios clínicos, com um total de 27 pacientes, utilizaram vetor AAV1 para expressar uma variante do LPL transgene, denominado alipogene tiparvovec, com excelentes resultados⁵².

Dentre as doenças não monogênicas, nas quais vetores adenoassociados têm sido reportados, estão a artrite reumatoide⁵³ e a doença de Parkinson^25,31,54.

No entanto, os vetores possuem algumas desvantagens, como a capacidade de clonagem limitada e imprópria para a maioria dos genes terapêuticos. Como o AAV requer a conversão da fita simples de DNA em fita dupla de DNA antes que a expressão do gene comece, isso o torna um vetor de expressão muito lenta para algumas aplicações in vivo⁴⁸. Dentre as vantagens para o uso dos vetores de AAV, pode-se citar a baixa imunogenicidade, o amplo tropismo celular, o uso de vírus parental não patogênico para o hospedeiro e a capacidade de transdução em células que estejam ou não em divisão. Os vetores AAV podem ser utilizados em uma ampla variedade de células, incluindo células musculares, células do sistema nervoso central e hepatócitos, sendo o vetor de escolha em cerca de 100 ensaios clínicos com terapia gênica para doenças monogênicas⁵⁵.

VETORES BASEADOS EM HERPESVÍRUS

Os herpesvírus humanos (HHV) fazem parte da família Herpesviridae, são vírus de DNA envelopados e causam infecções líticas, latentes e/ou persistentes ou recorrentes³⁵. O HHV é de particular interesse para investigadores da terapia gênica, em especial o herpesvírus do tipo 1 (HHV-1), um vírus de DNA neurotrópico que abriga mais de 80 genes categorizados entre essenciais e não essenciais, de acordo com sua necessidade de replicação⁷.

A presença dos muitos genes não essenciais permite ao vírus um espaço de cerca de 30 a 50 kbp para a inserção de genes heterólogos, o que os torna excelentes vetores para a terapia gênica⁵⁶.

Durante o processo de replicação, os HHV codificam três grandes grupos de proteínas³⁵:

a) Proteínas iniciais imediatas (α), que consistem em proteínas importantes na regulação da transcrição gênica e controle da célula;

b) Proteínas iniciais (β), que consistem em mais fatores de transcrição e enzimas, incluindo a DNA polimerase;

c) Proteínas tardias (γ), que consistem principalmente em proteínas estruturais geradas após o início da replicação do genoma viral.

Atualmente, três diferentes classes de vetores são derivadas de HHV-1: vetores atenuados competentes em replicação; vetores recombinantes incompetentes em replicação; e amplicons (vetores dependentes de vírus defectivo-auxiliares). Para desenvolver os vetores atenuados competentes em replicação, são deletados os genes não essenciais para a replicação. Os vetores incompetentes em replicação são desenvolvidos pela deleção de um ou mais genes iniciais imediatos, os quais são fornecidos in trans por uma cepa de HHV competente em replicação, por um plasmídeo ou por células que expressam constitutivamente o gene deletado. A terceira classe de vetores, os amplicons, são os mais seguros por carregarem o mínimo de sequências virais e apresentarem baixa toxicidade e imunogenicidade⁵⁷.

A geração de HHV geneticamente construídos tem sido utilizada principalmente para o tratamento de doenças neuronais. Além das células não proliferativas, como as células neuronais, os vetores baseados em HHV também são desenvolvidos para transduzir células em divisão, como as células da glia do sistema nervoso central¹³.

O principal obstáculo no uso dos vetores baseados em HHV é a imunidade pré-existente, que eficientemente inativa as partículas vetoriais e elimina células transduzidas que expõem, em sua superfície, proteínas do HHV codificadas pelo vetor ou empacotadas na partícula. Outro fator preocupante seria a recombinação entre o vetor de HHV e o genoma selvagem do vírus presente na forma latente em células do hospedeiro¹⁹.

Como vantagens no uso desse tipo de vetor, reporta-se o amplo tropismo celular, a possibilidade de inserção de DNA heterólogo grande (até 50 kbp), o tropismo natural por células neuronais (vetores de HHV) e células B (vetores de vírus Epstein Barr), a boa adequação como vetores oncolíticos (altamente tóxicos para alguns tumores proliferativos) e a produção de partículas em altos títulos^35,56.

Muitos estudos demonstraram uma expressão transgênica estável em longo prazo no sistema nervoso quando utilizados vetores baseados em HHV-1. Os estudos pré-clínicos, utilizando modelos de doença neurológica, como glioma, neuropatia periférica, dor crônica e neurodegeneração, reportaram resultados promissores^58,59,60.

VETORES BASEADOS EM POXVÍRUS

Os poxvírus, incluindo o vírus da varíola (VARV), são partículas envelopadas complexas, com um genoma grande de DNA de fita dupla, de aproximadamente 190 kbp de comprimento⁶¹. Outro importante fator a ser considerado, é que esses vírus apresentam um alto número de genes (cerca de 250) e muitos deles podem ser deletados por serem dispensáveis para a replicação⁶².

O vírus Vaccinia (VACV) é o membro protótipo da família Poxviridae e, por isso, a maioria das pesquisas, utilizando vetores de poxvírus, tem sido focada em sua utilização. Assim como para todos os poxvírus, o VACV tem um ciclo completo de replicação dentro do citoplasma da célula hospedeira, apesar de ser um vírus de DNA⁶³.

O VACV pode abrigar genes heterólogos de até 25 kbp, tornando-os muito úteis para a expressão de genes maiores. Devido a sua capacidade de alta expressão do transgene e suas propriedades citolíticas, os vetores de poxvírus são mais utilizados para a produção de proteínas recombinantes, terapia contra o câncer e vacinação⁶⁴.

Para a construção de vetores baseados em poxvírus recombinantes, é necessário considerar dois pontos: os locais de inserção no genoma do VACV e os genes repórteres introduzidos. O genoma do VACV tem cerca de sete locais de inserção conhecidos, onde genes heterólogos podem ser inseridos. O local de inserção escolhido depende principalmente da aplicação futura dos vírus recombinantes^46,63,65.

Os vetores baseados em VACV desenvolvidos atualmente são altamente atenuados, restritos ao hospedeiro e utilizam cepas com quase nenhuma capacidade de replicação. As cepas mais utilizadas incluem o vírus Vaccinia Ankara modificado (MVA), a cepa NYVAC derivada da cepa Copenhagen, Avipoxvirus ALVAC e TROVAC (infectam aves)⁶⁶. O perfil de eficácia, quanto à capacidade de ativação da resposta imune, parece ser variado entre as diferentes cepas, sendo MVA a cepa que parece eliciar uma menor resposta imune⁶⁷.

Os vetores baseados em VACV são capazes de eliciar um efeito antitumoral em tumores hipóxicos. Esses tumores sólidos são caracterizados por regiões de baixo aporte de oxigênio, com consequente surgimento de áreas intratumorais mal vascularizadas, sendo resistentes à radioterapia ou à quimioterapia. Os vetores baseados em VACV são atrativos para tumores hipóxicos de difícil tratamento, como os tumores pancreáticos⁶⁸. Uma das abordagens utilizadas para a construção de mutantes de poxvírus oncolíticos consiste na deleção do gene de timidina quinase do genoma viral. Um estudo demonstrou o uso, em ensaios clínicos de fase II, do vetor oncolítico denominado JX-594 para tratamento de pacientes com câncer de fígado. Para tal propósito, o gene heterólogo GM-CSF (fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos) foi inserido no lócus de timidina quinase, gerando um vetor seletivo para o tumor⁶⁹.

Os vetores poxvírus apresentam, como principal vantagem, os múltiplos locais para a inserção do transgene. No entanto, como desvantagens, esses vetores são potencialmente citotóxicos, apresentam uma expressão transiente do transgene e são altamente imunogênicos¹⁹.