INTRODUÇÃO

O vírus Mayaro (MAYV) e o vírus Chikungunya (CHIKV) são arbovírus pertencentes à família Togaviridae, gênero Alphavirus. O MAYV foi isolado pela primeira vez em 1954, em amostras de trabalhadores rurais em Trinidad e Tobago e, posteriormente isolado na área do rio Guamá, no estado do Pará, Brasil. O CHIKV foi isolado pela primeira vez na Tanzânia, em 1952, durante um surto atribuído ao vírus da Dengue (DENV)^1,2,3,4,5.

Surtos e epidemias de febre de Mayaro foram registrados no Brasil, Bolívia e Peru. No norte do Brasil, existem relatos de vários surtos ocorridos em cidades do estado do Pará, como Belterra (1978), Conceição do Araguaia (1981) e Benevides (1991) e no estado do Amazonas, em Manaus (2007-2008)⁶. No período de 2014 a 2016, foram notificados e distribuídos 343 casos suspeitos humanos de febre de Mayaro em 11 estados brasileiros, destacando-se o estado de Goiás que apresentou a maior frequência⁷. Por outro lado, o primeiro caso autóctone de febre Chikungunya ocorreu nas Américas em 2013, na região do Caribe, chegando ao Brasil em 2014 e causando dezenas de milhares de casos^8,9. De 2014 a 2017, 505.723 casos humanos suspeitos de febre de Chikungunya foram relatados no Brasil^{9,10,11,12,13}.

Nos seres humanos, a infecção pelo MAYV é esporádica, afetando principalmente pessoas provenientes de florestas tropicais, onde seu principal vetor é o mosquito Haemagogus janthinomys. Em relação ao CHIKV, um ciclo selvagem e periurbano da doença foi descrito na África, transmitido pelo Aedes aegypti, e sua disseminação para o Oceano Índico, Ásia e Europa estava relacionada à presença do vetor Aedes albopictus^3,4,5,7,14.

A condição clínica do paciente afetado pela febre de Mayaro é de início repentino, caracterizada por febre atingindo 39 °C, dor de cabeça, mialgia, erupção cutânea (principalmente no peito, costas, braços e pernas), dor intensa nas articulações dos pulsos, tornozelos, dedos, joelhos e cotovelos, bem como na coluna lombar e sacral. Da mesma forma, a febre de Chikungunya é caracterizada por poliartrite/artralgia simétrica nos pulsos, tornozelos e cotovelos, e pode regredir após 10 dias de infecção ou progredir para cronicidade^{4,5,7,14,15,16,17}.

O método mais específico para o diagnóstico de infecções por arbovírus é a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR), mas o isolamento do vírus seguido de imunofluorescência (IF) é considerado o método padrão-ouro para detectar o agente infeccioso. Tentativas de isolamento de vírus podem ser realizadas por inoculação em culturas de células de camundongos albinos suíços recém-nascidos (2 a 3 dias) e, eventualmente, também em mosquitos^1,18.

As culturas de células de artrópodes têm sido cada vez mais utilizadas, pois demonstram sensibilidade ao isolamento de vírus semelhante a camundongos lactantes. Entre as linhagens celulares de artrópodes mais utilizadas estão as células C6/36 de Aedes albopictus, células AP-61 de Aedes pseudoscutellaris e células TRA-284 de Toxorhynchites amboinensis^1,16,19. As culturas de células vertebradas também são amplamente utilizadas e incluem células VERO do rim de macaco verde africano (Chlorocebus aethiops), células BHK-21 do rim de hamster bebê (Mesocricetus auratus) e células LLC-MK2 do rim de macaco rhesus (Macaca mulatta)^16,20.

Sobre muitos arbovírus, pouco ou nada se sabe sobre suas características ecopidemiológicas e moleculares e sua capacidade de infectar várias linhagens celulares disponíveis atualmente. Assim, este trabalho teve como objetivo traçar o perfil de infecção de MAYV e CHIKV em quatro linhagens celulares, analisando a suscetibilidade e a permissividade das células BHK-21 e LLC-MK2 às infecções por alphavirus em comparação às células C6/36 e VERO, que são mais frequentemente utilizadas em laboratórios específicos. Além disso, foram realizados estudos da cinética de replicação viral para acompanhar a progressão da infecção pelo vírus nessas linhagens celulares, avaliando o efeito citopático (CPE), detecção de antígeno do vírus e a progênie de carga RNA.

MATERIAIS E MÉTODOS

RESULTADOS

PROGRESSÃO DO CPE E TITULAÇÃO DO ESTOQUE DE VÍRUS

O título CHIKV foi de 5,4 x 10⁷ PFU/mL, enquanto o título MAYV foi de 3,2 x 10⁸ PFU/mL. Nas células BHK-21 (Figura 1A) infectadas com CHIKV, a manifestação de CPE ocorreu a partir de 24 hpi; aos 48 hpi, a presença de CPE era mais evidente; e, a partir de 72 hpi, a monocamada foi totalmente destruída. O mesmo padrão foi observado no MAYV nessas células, porém o CPE foi detectado precocemente com apenas 12 hpi. Nas células C6/36 infectadas por vírus (Figura 1B), não foi observado CPE. As células LLC-MK2 infectadas por vírus (Figura 1C) apresentaram CPE relativamente mais tarde, de 48 hpi em culturas MAYV e 72 hpi em células infectadas por CHIKV, que progrediram com a destruição da monocamada a 96 hpi. As células VERO infectadas por vírus (Figura 1D) mostraram manifestação de CPE de 24 hpi com efeito mais proeminente nas culturas de MAYV neste momento; e uma rápida progressão para ambos os vírus em direção à destruição da monocamada nos pontos de tempo subsequentes.

As células BHK-21 (A), C6/36 (B), LLC-MK2 (C), e VERO (D) foram infectadas com CHIKV (painéis a esquerda) ou MAYV (painéis a direita) sob o MOI de 1 PFU/célula para os tempos indicados após a infecção, quando suas imagens de luz transmitidas foram registradas para medir o CPE pelo LM, usando um anel de contraste de fase. As imagens representam três campos visuais selecionados aleatoriamente para cada condição.

Figura 1 - Progressão da CPE em células infectadas por alphavirus 

Nas células BHK-21, VERO e LLC-MK2 infectadas com MAYV e CHIKV, foi observada a ocorrência de tipo lítico de CPE, causando a pilhagem das células mortas, bem como a sua refração até a completa destruição da monocamada. Não foram observadas diferenças morfológicas entre as células infectadas com MAYV e CHIKV. Os controles negativos de cada linha de células são apresentados na figura 2.

As células BHK-21, C6/36, LLC-MK2, e VERO foram cultivadas por 48 h, quando suas imagens de luz transmitidas foram registradas para medir o CPE pelo LM, usando um anel de contraste de fase. As imagens representam três campos visuais selecionados aleatoriamente para cada condição.

Figura 2 - O CPE em células não infectadas 

PROGRESSÃO DA DETECÇÃO DE ANTÍGENOS POR VÍRUS

Em relação ao IF das células BHK-21 infectadas com CHIKV (Figura 3A, painéis esquerdos), a positividade de 1+ foi observada a 12 hpi e 2+ a 24 hpi; às 48 hpi, a fluorescência progrediu para a positividade de 3+; e, nos momentos subsequentes, houve estabilização da positividade em 3+. Por outro lado, as células BHK-21 infectadas com MAYV (Figura 3A, painéis à direita) já mostravam a positividade de 1+ a 6 hpi; às 12 e 24 hpi, houve positividade de 2+; às 48 hpi, a fluorescência progrediu para a positividade de 3+; a partir de 72 hpi, houve positividade de 4+.

As células C6/36 infectadas com CHIKV (Figura 3B, painéis à esquerda) mostraram apenas uma célula positiva a 6 hpi no FII, com progressão nas horas subsequentes: a 12 hpi com a positividade de 2+ e a 24, 48, 72, e 96 hpi com positividade de 3+. As células C6/36 infectadas com MAYV (Figura 3B, painéis à direita) mostraram a positividade de 1+ a 6 hpi e 2+ a 12 hpi, tendo uma progressão diretamente para 3+ a 24 hpi; a partir de 48 hpi, houve positividade de 4+.

Em relação às células LLC-MK2 infectadas com CHIKV (Figura 3C, painéis à esquerda), a positividade de 1+ foi observada a 24 hpi, aumentando diretamente para 3+ de 48 hpi a 96 hpi. Em contraste, as células LLC-MK2 infectadas com MAYV (Figura 3C, painéis à direita) já haviam mostrado a positividade de 1+ a 6 hpi e 12 hpi; às 24 hpi e 48 hpi foi observada positividade de 2+ e 3+, respectivamente; houve positividade de 4+ a partir de 72 hpi.

As células VERO infectadas com CHIKV (Figura 3D, painéis à esquerda) ou MAYV (Figura 3D, painéis à direita) já haviam mostrado positividades semelhantes no ensaio iIF, com 2+ a 6 hpi e 12 hpi, crescendo posteriormente para 3+ a 24 hpi. Ambos os vírus resultaram na mesma positividade de 4+ às 48 hpi, com a estabilização da positividade em 4+ nas horas subsequentes.

As células BHK-21 (A), C6/36 (B), LLC-MK2 (C), and VERO (D) foram infectadas com CHIKV (painéis à esquerda) ou MAYV (painéis à direita) sob o MOI de 1 PFU/célula para os tempos indicados após a infecção, quando foram fixados para medir a detecção de antígenos por IF, usando anticorpos primários específicos e anticorpos secundários marcados com FITC. As imagens representam três campos visuais selecionados aleatoriamente para cada condição.

Figura 3 - Progressão da detecção de antígeno do vírus em células infectadas por alphavirus 

Todas as análises de cultura de células mostraram maior intensidade de fluorescência nas células infectadas pelo MAYV.

Os controles negativos do IF de cada linha de células são apresentados na figura 4.

As células BHK-21, C6/36, LLC-MK2, e VERO foram cultivadas por 48 h, quando fixadas para medir a detecção de antígeno por IF usando anticorpos primários antialphavirus e anticorpos secundários marcados com FITC. As imagens representam três campos visuais selecionados aleatoriamente para cada condição.

Figura 4 - A detecção do antígeno do vírus em células não infectadas 

PROGRESSÃO DA CARGA DE RNA NO SOBRENADANTE

Conforme avaliado por qRT-PCR no sobrenadante de culturas celulares, em células BHK-21 infectadas com CHIKV (Figura 5A, barras pretas), o RNA viral foi detectado a 6 hpi (3,60 x 10³ cópias/μL), com aumento nesse valor nos tempos subsequentes de 12 hpi (8,68 x 10³ cópias/μL), 24 hpi (2,60 x 10⁴ cópias/μL), 48 hpi (3,31 x 10⁵ cópias/μL), e 72 hpi (3,81 x 10⁵ cópias/μL). Eventualmente, houve uma queda na carga viral em 96 hpi (2,84 x 10⁵ cópias/μL). Por outro lado, as células BHK-21 infectadas com MAYV (Figura 5A, barras cinza) apresentaram carga viral crescente - 4,87 x 10² cópias/μL a 6 hpi, 6,85 x 10³ cópias/μL a 12 hpi, 9,82 x 10⁴ cópias/μL a 24 hpi, 6,63 x 10⁵ cópias/μL a 48 hpi, 6,87 x 10⁵ cópias/μL a 72 hpi e 1,28 x 10⁶ cópias/μL a 96 hpi.

As células C6/36 infectadas com CHIKV (Figura 5B, barras pretas) apresentaram cargas de RNA de 2,76 x 10² cópias/μL a 6 hpi, 9,36 x 10² cópias/μL a 12 hpi, 1,27 x 10³ cópias/μL a 24 hpi, 1,14 x 10⁴ cópias/μL a 48 hpi, 3,60 x 10⁵ cópias/μL a 72 hpi e 8,76 x 10⁵ cópias/μL a 96 hpi. As células C6/36 infectadas pelo MAYV (Figura 5B, barras cinza) mostraram 3,36 x 10² cópias/μL a 6 hpi, 1,08 x 10³ cópias/μL a 12 hpi, 2,25 x 10³ cópias/μL a 24 hpi, 2,14 x 10⁴ cópias/μL a 48 hpi, 4,42 x 10⁵ cópias/μL a 72 hpi e 6,86 x 10⁵ cópias/μL a 96 hpi.

As células LLC-MK2 infectadas com CHIKV (Figura 5C, barras pretas) mostraram um aumento na carga de RNA ao longo do tempo: 2,62 x 10² cópias/μL a 6 hpi, 6,45 x 10⁵ cópias/μL a 12 hpi, 4,54 x 10⁶ cópias/μL a 24 hpi, 8,89 x 10⁶ cópias/μL a 48 hpi, 9,16 x 10⁶ cópias/μL a 72 hpi e 1,26 x 10⁷ cópias/μL a 96 hpi. As células LLC-MK2 infectadas com MAYV (Figura 5C, barras cinza) também mostraram carga viral progressiva, exibindo 2,00 x 10² cópias/μL a 6 hpi, 1,84 x 10³ cópias/μL a 12 hpi, 5,31 x 10⁵ cópias/μL a 24 hpi, 8,74 x 10⁵ cópias/μL a 48 hpi, 9,97 x 10⁵ cópias/μL a 72 hpi e 1,97 x 10⁶ cópias/μL a 96 hpi.

As células VERO infectadas com CHIKV (Figura 5D, barras pretas) apresentaram cargas de RNA de 3,98 x 10² cópias/μL, 7,00 x 10³ cópias/μL, 1,28 x 10⁴ cópias/μL, 3,98 x 10⁴ cópias/μL, 2,48 x 10⁵ cópias/μL e 2,55 x 10⁵ cópias/μL a 6 hpi, 12 hpi, 24 hpi, 48 hpi, 72 hpi e 96 hpi, respectivamente. As células VERO infectadas com MAYV (Figura 5D, barras pretas) apresentaram as seguintes cargas de RNA: 1,82 x 10² cópias/μL a 6 hpi, 9,03 x 10² cópias/μL a 12 hpi, 2,24 x 10⁴ cópias/μL a 24 hpi, 6,91 x 10⁴ cópias/μL a 48 hpi, 3,48 x 10⁵ cópias/μL a 72 hpi e 4,88 x 10⁵ cópias/μL a 96 hpi.

As células BHK-21 (A), C6/36 (B), LLC-MK2 (C), e VERO (D) foram infectadas com CHIKV (barras pretas) ou MAYV (barras cinzas) sob o MOI de 1 PFU/célula para os tempos indicados após a infecção, quando seus sobrenadantes foram colhidos para medir a carga de RNA por RT-qPCR, usando conjuntos específicos de iniciador/sonda. Os dados foram obtidos de três experiências e plotados como média ± desvio padrão para cada condição.

Figura 5 - A progressão da carga de RNA no sobrenadante de células infectadas por alphavirus 

DISCUSSÃO

Este estudo teve como objetivo comparar o perfil de duas infecções por alphavirus de importância em saúde pública na região amazônica brasileira: o MAYV, detectado pela primeira vez no Brasil em 1955²⁹, e o CHIKV detectado pela primeira vez no Brasil em 2014³⁰. As principais linhagens celulares usadas para o diagnóstico laboratorial desses arbovírus são C6/36 e VERO, que certamente representam bons sistemas de isolamento de vírus. No entanto, poucos estudos tentaram analisar a suscetibilidade de outras linhagens celulares, como BHK-21 e LLC-MK2, em comparação com os mencionados anteriormente, além de analisar o início da detecção por meio dos testes IF e qRT-PCR.

Este estudo demonstra que, para ambos os alphavirus, as células VERO e BHK-21 apresentaram CPE anterior, o que já era observado a 12 hpi em ambas as células, quando comparado às células C6/36 e LLC-MK2. As células C6/36 não apresentaram CPE, como já era esperado, já que a maioria das infecções por arbovírus não levou à morte nessa linhagem celular, e as células LLC-MK2 começaram a apresentar CPE a partir de 48 hpi. Vale ressaltar que o CPE observado em todas as culturas que mostraram ser do tipo lítico, com destruição completa da monocamada e grande quantidade de células mortas arredondadas.

Ao comparar as infecções por MAYV e CHIKV, observou-se um CPE mais pronunciado em culturas de células infectadas com MAYV (VERO, BHK-21 e LLC-MK2), a partir de 12 hpi. Nas culturas de células infectadas com CHIKV, o aparecimento de CPE às 24 hpi foi um pouco mais suave. No entanto, a partir de 48 hpi em geral, as culturas celulares infectadas por um ou outro vírus apresentaram um padrão semelhante de CPE, exceto as células LLC-MK2, que ainda continuavam apresentando um CPE um pouco mais avançado quando infectadas com MAYV.

Em relação aos resultados da detecção de vírus por IF para CHIKV, as células VERO apresentaram a positividade mais avançada (a 6 hpi), seguida pelas células C6/36, indicando que para esse vírus essas culturas, muito usadas na rotina laboratorial, são melhores para o início detecção de vírus por iIF. Quando as outras culturas celulares foram analisadas, observou-se que, para fins de diagnóstico, para obter positividade em poucos dias, a cultura das células BHK-21 (2+ positividade a 12 hpi) era melhor que a das células LLC-MK2 (1 + positividade a 12 hpi).

Por outro lado, em relação ao MAYV, o teste de IF mostrou uma evolução da positividade até atingir 4+ em todas as linhagens celulares estudadas, mencionando que a maioria dessas culturas celulares apresentava padrão de positividade semelhante, atingindo a positividade de 4+ já a 48 hpi. Assim, pode-se sugerir que qualquer uma das linhagens celulares estudadas possa ser utilizada para fins de diagnóstico, visando à detecção precoce do MAYV, e que as células LLC-MK2 e BHK-21 são boas alternativas à falta de células C6/36 ou VERO em laboratório.

Em relação às cargas de RNA nos sobrenadantes da cultura de células, comparando células BHK-21 infectadas com MAYV ou CHIKV, foram obtidos valores mais altos para MAYV. Tal resultado corrobora os dados obtidos pelo IF, nos quais o MAYV mostrou a positividade de 4+ e o CHIKV, a positividade de 3+ nos últimos momentos estudados. Nas células LLC-MK2, a carga de RNA foi maior no CHIKV do que no MAYV, essa foi a linhagem celular que apresentou o maior título entre todas as culturas celulares analisadas, apontando que as células que não são frequentemente utilizadas na rotina laboratorial apresentam bons resultados na detecção de vírus. Os resultados de qRT-PCR para células LLC-MK2, quando comparados com os resultados de IF, podem parecer inconsistentes, observa-se que o ensaio de qRT-PCR é mais específico que o ensaio de iIF, pois o primeiro é quantitativo e o último é semiquantitativo e depende da especificidade dos anticorpos utilizados.

Quanto às cargas de RNA da cultura de células C6/36, o CHIKV atingiu um valor mais alto no último momento analisado (96 hpi); no entanto, nos demais momentos estudados, o MAYV apresentou valores mais altos. Esses resultados corroboram os do teste de IF em relação à maior positividade para o MAYV às 48 e 72 h, quando comparados ao CHIKV nos mesmos momentos. Por outro lado, as cargas de RNA obtidas com a cultura de células VERO foram mais altas para MAYV durante a maior parte do estudo (24 a 96 hpi), embora os resultados do teste IF indicassem semelhança entre MAYV e CHIKV desde o início detecção de vírus a 6 hpi até o último momento testado. No entanto, o CHIKV apresentou maiores valores de carga de RNA por RT-qPCR em relação ao MAYV.

Simon et al.³¹ relataram que o diagnóstico de CHIKV foi realizado por RT-PCR e também destacaram o uso de células C6/36 e VERO para o isolamento e estudo desse vírus. Dado o uso quase exclusivo dessas duas linhagens celulares para o diagnóstico de arbovírus, nota-se a relevância deste estudo na tentativa de compreender o comportamento dos alphavirus em outras linhagens celulares que não são comumente usadas na rotina laboratorial, como BHK-21 e principalmente células LLC-MK2.

No estudo de Way et al.³², 20 arbovírus - incluindo nove alphavirus - foram testados em ambos os sistemas de isolamento de vírus (camundongos e cultura de células), e as células VERO e LLC-MK2 apresentaram o maior grau de infecção quando comparadas às células BHK-21. Isso corrobora o presente estudo, mostrando que os maiores valores de carga de RNA foram obtidos em células LLC-MK2.

Segundo Tesh³³, a linhagem celular mais utilizada na rotina laboratorial para propagação de arbovírus é o C6/36, devido à sua fácil manutenção e crescimento a 28 °C. Figueiredo³⁴ realizou a propagação de 23 arbovírus em células C6/36, sendo o MAYV um dos arbovírus estudados. Não foi observado CPE nessas células, e o IF para alphavirus mostrou positividade após dois a três dias de infecção. Esses resultados corroboram o presente estudo, que mostrou que não foi observado CPE para os alphavirus estudados em células C6/36; no entanto, neste estudo, a detecção do antígeno do vírus pelo IF foi possível a partir de 6 hpi, o que provavelmente pode ser explicado pelo MOI ser menor nas amostras do estudo de Figueiredo.

Devido à boa adaptação do CHIKV às células BHK-21, essa linhagem celular está sendo usada atualmente para realizar estudos de pequenas mutações nas glicoproteínas do envelope viral que facilitam a adaptação do vírus ao vetor artrópode³⁵.

Lim e Chu³⁶ realizaram uma cinética de replicação do CHIKV em células VERO infectadas sob o MOI de 10, com pontos de tempo de 0, 12, 24, 36 e 48 hpi, e observaram CPE de 36 hpi e maior intensificação a 48 hpi; no mesmo estudo, também foi realizada a quantificação do RNA viral por meio do qRT-PCR, e observou-se a maior carga de RNA às 24 hpi, com 5,0 x 10⁸ PFU/mL. No presente estudo, foi realizada a cinética de replicação com 6, 12, 24, 48, 72 e 96 hpi, com início da CPE em células VERO infectadas com CHIKV já a 24 hpi, o que corrobora o estudo citado³⁶, visto que o CPE começa a se desenvolver a partir de 24 hpi, porém a 48 hpi encontra-se avançado. No entanto, dado o MOI inicial dez vezes menor, a carga de RNA, neste estudo, também foi menor que a do estudo de Lim e Chu, atingindo um pico de 96 hpi com 2,55 x 10⁵ cópias/μL para CHIKV em células VERO.

Lee e Chu³⁷ conseguiram replicar o CHIKV em células C6/36 para estudar várias proteínas que interferem na replicação do vírus em células artrópodes, corroborando o presente estudo, demonstrando que as células C6/36, embora não apresentem CPE, fornecem bons resultados em testes de IF e qRT-PCR.

Em conjunto, esses achados sugerem que as células VERO, BHK-21 e LLC-MK2 são as células de escolha para os ensaios de monitoração e titulação de CPE e formação de placas. Embora as células C6/36 não demonstrem CPE para os dois vírus experimentados em questão, elas apresentam excelentes resultados com detecção precoce, justificando seu amplo uso no diagnóstico laboratorial. No entanto, este trabalho também mostra que outras linhagens celulares menos utilizadas na rotina de diagnóstico, como BHK-21 e especialmente LLC-MK2, permitem excelentes cargas de RNA. Além disso, ao comparar o MAYV com o CHIKV, foi geralmente observado que o MAYV alcançou cargas de RNA mais altas, bem como início precoce da detecção de CPE e IF - provavelmente porque a amostra do MAYV foi isolada em 1960, sofrendo um número maior de passagens do que a cepa CHIKV isolada mais recentemente.

Além disso, estudos como este são importantes para mostrar o melhor momento para colher células infectadas que servirão como fontes de vírus para técnicas como o sequenciamento de nucleotídeos, que requer uma grande quantidade de RNA viral; por exemplo, com a linhagem celular BHK-21, a maior carga de RNA alcançada para CHIKV foi de 72 hpi e, para MAYV, de 96 hpi. Isso indica que existem diferentes perfis de replicação entre vírus em diferentes linhagens celulares.

Por fim, é sabido que muitas células utilizadas na rotina laboratorial já são padronizadas para o diagnóstico de arbovírus, porém é necessário que novos estudos sejam realizados com outras linhagens celulares para analisar sua suscetibilidade e permissividade ao crescente número de arbovírus medicamente importantes para a melhoria do diagnóstico virológico.

CONCLUSÃO

Esses dados mostram que outras células da linhagem, como BHK-21 e LLC-MK2, devem ser utilizadas como alternativa às células C6/36 e VERO ao diagnóstico laboratorial e às pesquisas com MAYV e CHIKV, visto que o MAYV parece ser mais virulento a essas linhagens que CHIKV.