INTRODUÇÃO

O gênero Biomphalaria Preston, 1910 inclui moluscos que podem transmitir Schistosoma mansoni, o agente etiológico da esquistossomose no Brasil. Entre as 11 espécies e uma subespécie do gênero Biomphalaria que ocorrem no país, três são consideradas hospedeiras intermediárias de S. mansoni: Biomphalaria glabrata (Say, 1818), Biomphalaria tenagophila (d'Orbigny, 1835) e Biomphalaria straminea (Dunker 1848). No Estado do Pará, as espécies B. glabrata, B. straminea, Biomphalaria schrammi (Crosse, 1864) e Biomphalaria kuhniana (Clessin, 1883) já foram relatadas¹.

A determinação de espécies do gênero Biomphalaria é baseada na comparação de caracteres morfológicos de conchas, do sistema excretor e de órgãos reprodutivos²; no entanto, há dificuldades na determinação, devido ao tamanho das amostras, processos de fixação inadequados e semelhanças interespecíficas³. Essas semelhanças culminaram no agrupamento de algumas espécies do gênero Biomphalaria em dois complexos: 1) B. straminea composto por B. straminea, Biomphalaria intermedia (Paraense & Deslandes, 1962) e B. kuhniana; e 2) B. tenagophila contendo B. tenagophila, Biomphalaria tenagophila guaibensis Paraense, 1984, e Biomphalaria occidentalis Paraense, 1981^4,5,6,7. As espécies do complexo B. tenagophila são indistinguíveis da morfologia da concha e da maioria dos órgãos do sistema genital. E apenas B. tenagophila é suscetível à infecção por S. mansoni; portanto, a identificação dessas espécies é importante para estudos epidemiológicos da esquistossomose⁷, e o conhecimento da distribuição geográfica dessas espécies permite melhor distribuição de recursos e políticas adequadas para o controle do molusco⁸. A taxonomia molecular tem sido utilizada como ferramenta auxiliar para a morfologia quando não é suficiente para a identificação das espécies.

O presente trabalho teve como objetivo relatar a primeira ocorrência de B. occidentalis no estado do Pará, região norte do Brasil.

MATERIAIS E MÉTODOS

Levantamentos malacológicos foram realizados em maio de 2017, no município de Afuá, Mesorregião Marajó, no Estado do Pará, latitude 00º09'20,1"S e longitude 50º23'02,9"W.

Cinco espécimes foram coletados, utilizando-se pinças e redes em fossas de esgoto no perímetro urbano com período de coleta de 30 min. Nenhuma outra espécie de molusco ou vegetação foi observada nas valas de esgoto durante esse período. As características do ambiente, onde os espécimes foram coletados, foram favoráveis à ocorrência e dispersão de moluscos. Um receptor do Sistema de Posicionamento Global (GPS) GPSMAP^® 76CS da Garmin foi usado para registrar as leituras das coordenadas geográficas e todos os pontos de coleta foram anotados e georreferenciados.

Os moluscos obtidos foram acondicionados em gaze embebida em água, inseridos em sacos plásticos devidamente identificados, armazenados e transportados para o Laboratório de Parasitas Intestinais, Esquistossomose e Malacologia (LPIEM) da Seção de Parasitologia (SAPAR) do Instituto Evandro Chagas (IEC). Os cinco espécimes foram medidos e embalados individualmente em recipientes de vidro com 20 mL de água declorada, expostos à luz artificial (lâmpada incandescente de 60 W) por 30 min e, em seguida, examinados sob um estereomicroscópio para verificar a presença de cercárias de S. mansoni⁹. Posteriormente, os moluscos foram sacrificados, fixados^10,11 e o pé de cada espécime foi removido para extração de DNA pelo Kit de Purificação de DNA Wizard Genomic modificado (Promega).

Os moluscos foram identificados morfologicamente por comparação dos caracteres da concha e dos órgãos reprodutores masculino e feminino, de acordo com Paraense^2,4,5.

A identificação molecular foi realizada pelo Laboratório de Helmintologia e Malacologia Médica, Instituto René Rachou/Fiocruz, usando reação em cadeia da polimerase e polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (PCR-RFLP) da região do espaçador interno transcrito (ITS) dos genes ribossômicos do RNA, onde todo ITS foi amplificado com os primers ETTS2 (5 'TAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA 3') e ETTS1 (5 'TGCTTAAGTTCAGCGGGGT 3') ancorados, respectivamente, nas extremidades conservadas dos genes ribossômicos 18S e 28S¹². Em seguida, foi realizada a clivagem desse fragmento com as enzimas de restrição Ddel e Alul^7,13.

RESULTADOS

Todas as amostras examinadas quanto à presença de cercárias de S. mansoni foram negativas para o parasita e para outras larvas de trematódeos.

Todos os moluscos foram identificados morfologicamente como B. occidentalis (Figura 1).

A: Concha; B: Sistema reprodutivo; C: Manto com tubo renal.

Figura 1 - Biomphalaria sp. de Afuá, Pará, Brasil 

Os resultados moleculares que mostram os perfis de restrição obtidos pela digestão da região ITS do DNA ribossômico com Ddel foram comparados com o padrão de perfis de DNA obtidos no tecido dos moluscos Biomphalaria e Helisoma da Coleção de Malacologia Médica (Fiocruz/CMM) (Figura 2).

Coluna 1: Biomphalaria sp. de Afuá, Pará; Coluna 2: B. occidentalis de Belo Horizonte, Minas Gerais; Coluna 3 e 4: Helisoma sp. de Três Lagoas, Mato Grosso do Sul; Coluna 5: B. glabrata de Belo Horizonte, Minas Gerais; Coluna 6: B. tenagophila de Sabará, Minas Gerais; Coluna 7: Biomphalaria peregrina de Coromandel, Minas Gerais. Os números à esquerda do gel são o valor em pares de bases (bp) dos marcadores de tamanho molecular Phi X 174/HaeIII.

Figura 2 - Gel de poliacrilamida corado com prata (6%) mostrando perfis de restrição obtidos por digestão da região ITS do DNA ribossômico com DdeI 

Para diferenciar as espécies, o âmplicon, previamente obtido de aproximadamente 1.200 pares de bases, foi submetido a uma nova RFLP utilizando a enzima de restrição Alul⁷, sendo possível definir a espécie como B. occidentalis por técnica molecular (Figura 3).

Coluna 1: B. tenagophila de Sabará, Minas Gerais; Colunas 2 e 3: B. t. guaibensis de Santa Vitória do Palmar, Rio Grande do Sul; Coluna 4: Biomphalaria sp. de Afuá, Pará; Colunas 5 e 6: B. occidentalis de Belo Horizonte, Minas Gerais. Os números à esquerda do gel são o valor em pares de bases (bp) dos marcadores de tamanho molecular Phi X 174/HaeIII.

Figura 3 - Gel de poliacrilamida corado com prata (6%) mostrando perfis de restrição obtidos por digestão da região ITS do DNA ribossômico com AluI 

DISCUSSÃO

A distribuição geográfica dos moluscos planórbidos no Brasil não é devidamente conhecida, em razão da grande extensão territorial e da falta de recursos humanos e econômicos; no entanto, o número de estudos com o objetivo de conhecer melhor a fauna malacológica em algumas regiões aumentou^14,15.

O presente estudo é o primeiro relato de B. occidentalis no Estado do Pará. No Brasil, essa espécie já foi encontrada nos estados do Acre, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Paraná, Rio Grande do Sul, Rondônia, Santa Catarina, São Paulo, e existem relatos de conchas no Amazonas^1,4,16.

Os moluscos de água doce B. occidentalis, B. tenagophila e B. t. guaibensis são morfologicamente semelhantes, agrupados no complexo B. tenagophila. Apesar da semelhança morfológica entre as espécies do complexo, apenas B. tenagophila é suscetível a S. mansoni, vários estudos reforçaram B. occidentalis como espécies refratárias^17,18,19; portanto, a distinção dessas espécies é importante para estabelecer áreas vulneráveis ao risco de ocorrência da esquistossomose.

Estudos sobre a fauna planorbídica, em todas as áreas do Brasil, principalmente em regiões menos investigadas, devem ser motivados pelo objetivo de se conhecer a distribuição geográfica dos moluscos Biomphalaria, visando melhor distribuição de recursos e vigilância adequada para seu controle.

CONCLUSÃO

Este estudo apresenta o primeiro registro de B. occidentalis no município de Afuá, Estado do Pará.

Além disso, foi ampliado o conhecimento sobre a dispersão e diversidade dos moluscos do gênero Biomphalaria na Amazônia brasileira.