INTRODUCCIÓN

Las infecciones del tracto urinario se encuentran entre las enfermedades infecciosas más comunes que afectan a la población¹. Aproximadamente el 60% de las mujeres entre 18 y 24 años de edad tendrán al menos una infección urinaria sintomática durante su vida, y el 5% de ellas tendrán episodios recurrentes².

Los principales microorganismos relacionados con las infecciones del tracto urinario son las enterobacterias, especialmente Escherichia coli, considerado el agente etiológico más prevalente, responsable del 80% de las infecciones. Otros uropatógenos comunes son Staphylococcus saprophyticus (15%), seguido de Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Pseudomonas y Serratia. Los cocos grampositivos como Enterococcus, Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae todavía están involucrados³.

Además de estos, los microorganismos del género Mycoplasma y Ureaplasma son clínicamente importantes, ya que son responsables por el desarrollo de diversas enfermedades, principalmente enfermedades genitourinarias y respiratorias⁴. Pertenecen a la clase Mollicutes y se caracterizan por ser los organismos más pequeños capaces de autorreplicarse, tener un genoma reducido y ausencia de pared celular⁵. Este hecho lleva a la no susceptibilidad de estos microorganismos a los antibióticos que actúan a nivel de la pared celular. La infección por estos agentes se asocia con inmunodepresión, obstrucción o instrumentación urinaria previa⁶.

Las especies Mycoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum son las principales causas de infecciones urogenitales entre los micoplasmas⁷. El U. urealyticum se asocia a uretritis no-gonocócica. La especie M. hominis fue aislada de pacientes con pielonefritis aguda, también correlacionada con enfermedad inflamatoria pélvica, vaginosis bacteriana y, en mujeres embarazadas, abortos espontáneos, partos prematuros y fiebre posparto⁸. Además de estos, la especie Mycoplasma genitalium ha sido reportada como causante de uretritis en hombres y cervicitis mucopurulenta en mujeres⁹.

Debido a los problemas asociados al tratamiento de diversas infecciones, especialmente la resistencia a los antibióticos, las sustancias vegetales han adquirido nuevas perspectivas, como el creciente interés de su uso en la búsqueda de compuestos antimicrobianos^10,11.

El uso de plantas para curar o combatir enfermedades es muy antiguo¹², siendo todavía una práctica muy presente en la vida cotidiana de la población. Según datos de la Organización Mundial de la Salud, alrededor del 65 al 80% de la población mundial no tiene acceso a la atención primaria de salud y recurre a la medicina tradicional, especialmente a las plantas medicinales, en busca de alivio para muchas enfermedades¹⁰.

Estudios han demostrado que las plantas, incluidas las de uso popular, producen metabolitos activos, que presentan actividades antibacterianas, antihelmínticas, antifúngicas, antivirales, antivirales, antiinflamatorias, antioxidantes, entre otros¹¹ descubrimientos que han hecho de las plantas una de las fuentes para el desarrollo de nuevos fármacos¹³.

El género Alternanthera (Amaranthaceae) está formado por 80 especies, ampliamente distribuidas por todo el mundo, el 25% de las cuales se encuentran en Brasil¹⁴. Son plantas nativas de las regiones costeras y amazónicas. La especie Alternanthera brasiliana (L.) Kuntze es comúnmente conocida como "penicilina", "terramicina" o "doril" y es utilizada en medicina tradicional para el tratamiento de diarrea, cistitis, garganta e infecciones generales^15,16. La infusión de sus hojas es considerada diurética, siendo utilizada para enfermedades hepáticas y vesicales¹⁷.

Ya el género Phyllanthus (Phyllanthaceae), conocido popularmente como "chancapiedra", se encuentra en Brasil, en toda la región tropical¹⁷. Las plantas de ese género, especialmente Phyllanthus niruri L., se recomiendan en la medicina popular para el tratamiento de problemas renales, gastroenteritis, infecciones genitourinarias, hepatitis B y diabetes^{11,12,14,17,18,19}.

Plantago major L. (Plantaginaceae), también conocida como "Llantén", es una hierba pequeña, nativa de Europa y naturalizada en todo el sur de Brasil¹⁷. Estudios etnofarmacológicos mostraron que P. major se utiliza en el tratamiento de muchas patologías, como enfermedades de piel, infecciones, problemas digestivos, respiratorios, circulatorios, entre otros²⁰.

Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. pertenece a la familia Ericaceae y se utiliza principalmente como antiséptico, antiinflamatorio y en el tratamiento de infecciones del tracto urinario como cistitis, uretritis, disuria y pielonefritis. Esta planta fue introducida, en la práctica médica, en la región de Europa, y sigue siendo uno de los desinfectantes más comunes e importantes del tracto urinario, con respecto a las diferentes especies de hierbas medicinales. Su principal componente medicinal activo es la arbutina, un glucósido fenólico que genera hidroquinona como resultado de la glucólisis, y una pequeña cantidad de hidroquinona libre se encuentra en las hojas. El ácido p-cumárico y el ácido cafeico, también encontrados en la especie, son componentes con propiedades antibacterianas y el ácido salicílico, conocido por su acción antiinflamatoria y bacteriostática²¹.

Frente a este contexto, los objetivos de este trabajo fueron de evaluar la actividad antibacteriana de A. brasiliana, P. major, A. uva-ursi y P. niruri, plantas medicinales de uso popular, delante de diferentes especies de bacterias causadoras de infecciones urogenitales, bien como analizar sus perfiles cromatográficos. Es importante destacar que este es el primer trabajo que evalúa la actividad antimolicute de esas especies.

MATERIALES Y MÉTODOS

ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO

Los extractos y fracciones sometidos a análisis en cromatografía de capa delgada (CCD) fueron seleccionados según los valores de la concentración mínima de inhibición (CIM), con el fin de correlacionar los perfiles cromatográficos con la actividad antibacteriana evidenciada. Los patrones cromatográficos de A. uva-ursi y P. niruri fueron seleccionados de acuerdo con los marcadores de identificación de estas especies, según la Farmacopea Brasileña IV²²; los de A. brasiliana, conforme el estudio de Pereira²³; y los de P. major, según Braz et al.²⁴. Cerca de 0,015 g de las muestras y patrones fueron pesados y diluidos en 1 ml de metanol, obteniendo una concentración final de 15 mg/ml de cada muestra.

Se utilizaron placas de sílice GF₂₅₄, de 6x8 cm de tamaño, y tanque de saturación con migración ascendente. Se aplicaron alícuotas de 5 μl de muestras y patrones a las placas, con la ayuda de una pipeta automática. Los sistemas eluentes y agentes cromogénicos utilizados en este estudio fueron seleccionados de acuerdo con la información obtenida previamente de la literatura y se describen en el cuadro 1.

NP: Difenilboriloxietilamina; PEG 4000: Polietilenoglicol 4000; UV 365 nm.

Cuadro 1 - Plantas, patrones, sistemas de eluentes y reveladores utilizados para la evaluación de CCD en las especies estudiadas 

RESULTADOS

Los resultados de la obtención de los extractos hidroalcohólicos (EH) y de las fracciones están en la tabla 1. Conforme los perfiles cromatográficos de las plantas evaluadas (Figura 1), A. brasiliana demostró, en las fracciones DCM y AcOEt, manchas que se asemejan al patrón β-sitosterol, cuando revelados con anisaldehído sulfúrico (Figura 1A). Las manchas de los patrones probados no se observaron en el extracto hidroalcohólico y en las fracciones de esa especie (Figura 1B). Conforme el cromatograma expuesto en la figura 1C, la fracción DCM de A. uva-ursi presentó una mancha característica para terpenos; mientras que el extracto hidroalcohólico y las fracciones AcOEt y BuOH presentaron manchas similares al patrón ácido gálico, cuando revelados con cloruro férrico 1% en metanol. Para la misma especie, los patrones ácido clorogénico y ácido salicílico no fueron observados, conforme el perfil cromatográfico revelado en las figuras 1E y 1F). Las fracciones AcOEt y BuOH de P. niruri demostraron manchas características de compuestos fenólicos (Figura 1G), así como para el extracto hidroalcohólico y la fracción AcOEt de P.major (Figura 1H).

A y B: Cromatogramas de A. brasiliana (AB); C, D, E y F: Cromatogramas de A. uva-ursi (AU); G: Cromatograma de P. niruri (PN); H: Cromatogramas de P. major (PM).

Cromatogramas: A - (1) β-sitosterol, (2) Extracto hidroalcohólico AB, (3) Fracción DCM AB, (4) Fracción AcOEt AB, Eluente: I, Revelador: a. B - (5) Ácido gálico, (6) Ácido clorogénico, (2) Extracto hidroalcohólico AB, (3) Fracción DCM AB, (4) Fracción AcOEt AB, Eluente: II, Revelador: b. C - (7) Hidroquinona, (5) Ácido gálico, (8) Extracto hidroalcohólico AU, (9) Fracción DCM AU, (10) Fracción AcOEt AU, (11) Fracción BuOH AU, (12) Fracción Aq AU, Eluente: IV, Revelador: d. D - (13) Arbutina, (8) Extracto hidroalcohólico AU, (9) Fracción DCM AU, (10) Fracción AcOEt AU, (11) Fracción BuOH AU, (12) Fracción Aq AU, Eluente: VI, Revelador: d. E - (6) Ácido clorogénico, (8) Extracto hidroalcohólico, (9) Fracción DCM AU, (10) Fracción AcOEt AU, (12) Fracción Aq AU, Eluente: V, Revelador: b. F - (14) Ácido salicílico, (8) Extracto hidroalcohólico AU, (9) Fracción DCM AU, (10) Fracción AcOEt AU, (11) Fracción BuOH AU, (12) Fracción Aq AU, Eluente: II, Revelador: d. G - (5) Ácido gálico (15), Extracto hidroalcohólico PN, (16) Fracción DCM PN, (17) Fracción AcOEt PN, (18) Fracción BuOH PN, Eluente: III, Revelador: c. H - (6) Ácido clorogénico, (19) Extracto hidroalcohólico PM, (20) Fracción DCM PM, (21) Fracción AcOEt PM, Eluente: VIII, Revelador: b.

Figura 1 - Resultados del análisis cromatográfico de las especies vegetales analizadas 

En las pruebas de microdilución realizadas frente a las cepas bacterianas, se verificó, de manera general, una actividad antibacteriana muy parecida entre los extractos y fracciones de las diferentes especies vegetales, mereciendo destaque la actividad de la Fracción AcOEt y extracto hidroalcohólico de A. uva-ursi, con CIM de 31,25 µg/ml y 125 µg/ml, respectivamente, frente a la cepa de S. aureus, conforme demostrado en la tabla 2.

DISCUSIÓN

Las plantas seleccionadas en esta investigación son muy buscadas por la población como remedio en el tratamiento de las infecciones urinarias, pero ningún estudio ha revelado aún su verdadera actividad antimicrobiana contra las cepas de molicutes.

De acuerdo con los rendimientos porcentuales, se observó que todas las especies presentaban alto rendimiento de Fracción Aq, lo que puede estar relacionado con la presencia mayoritaria de compuestos glicosilados y polímeros³⁰. Estudios cromatográficos sugieren que la especie A. brasiliana presentó menor complejidad química en las fracciones más apolares, demostrando un perfil cuantitativo diferente, en comparación con las especies P. niruri y P. major. Se observa que estas últimas especies mostraron alto rendimiento de Fracción BuOH, mientras que A. uva-ursi mostró buen rendimiento, tanto en las fracciones AcOEt como BuOH.

La especie A. brasiliana estuvo inactiva, tanto para el extracto hidroalcohólico como para las diferentes fracciones verificadas. Frente a las cepas de molicutes, las fracciones DCM y AcOEt estaban inactivas (MIC = 1.000 μg/ml), a excepción de la cepa M. genitalium, que no tuvo su crecimiento inhibido en presencia de Fracción DCM. El extracto hidroalcohólico y las otras fracciones eran inactivos. No se evidenció ninguna actividad contra las diversas especies de bacterias con pared celular. Este resultado está en línea con el evidenciado por Coutinho et al.³¹, que probaron el extracto etanólico de las hojas de A. brasiliana contra cepas de E. coli, S. aureus y Pseudomonas aeruginosa, y también se consideró inactivo ante los parámetros de Machado et al.²⁹.

Se han realizado varios estudios en la búsqueda de efectos antimicrobianos de esta especie vegetal, ya que se la conoce popularmente como "penicilina". Sin embargo, no se realizó ningún estudio con bacterias sin pared celular (molicutes). Pereira et al.³² evaluaron el extracto hidroalcohólico y la Fracción AcOEt de A. brasiliana y se encontraron valores de MIC = 1.250 μg/ml, contra S. aureus, y CIM > 2.500 μg/ml, contra E. coli y P. aeruginosa. No se evidenció actividad contra el hongo Saccharomyces cerevisiae, contra el cual el extracto hidroalcohólico fue fungistático y fungicida a una concentración de 625 μg/ml.

La ausencia de actividad antimicrobiana de A. brasiliana, reportada en el presente estudio y en trabajos anteriores, no corrobora los efectos terapéuticos reportados por el uso popular^15,16,17. Este hecho puede explicarse probablemente por el hecho de que esta especie no está relacionada con la lucha contra microorganismos a través de efectos bacteriostáticos o bactericidas, sino por su acción antiinflamatoria³². El análisis fitoquímico cualitativo de diferentes extractos de A. brasiliana reveló la presencia de compuestos como carbohidratos, alcaloides, saponinas, flavonoides, fenoles, taninos y proteínas³³. Los polifenoles, flavonoides y ácidos fenólicos tienen varias funciones, tales como actividad antioxidante, acción hormonal, estimulación enzimática y propiedades antibacterianas^33,34. Además de estos, se reportaron la acción antiinflamatoria y la presencia de compuestos con posible acción analgésica, lo que contribuiría al alivio de los síntomas de los procesos infecciosos y podría llevar a la idea de una posible acción antibacteriana^33,35. También puede haber inhibición de la formación de biopelículas, debido a un impedimento de la captación de estos microorganismos en superficies biológicas, como el arándano (Vaccinium macrocarpon)³⁶. Las biopelículas corresponden a una asociación entre células bacterianas, formando una matriz multicelular, que puede adherirse a superficies biológicas y no biológicas. Son sistemas complejos y dinámicos, que presentan un modo de crecimiento protegido contra las defensas del huésped, así como la acción de los antibióticos, además de permitir que los ICMrorganismos sobrevivan en ambientes hostiles^37,38. Tales hipótesis podrían justificar el uso de esta planta como medicina por parte de la población en procesos infecciosos in vivo.

En relación a bacterias con pared celular, Fracción AcOEt de A. uva-ursi fue capaz de inhibir el crecimiento de S. aureus a una concentración de 31,25 μg/ml, una excelente actividad que corresponde al mejor resultado de este estudio. El extracto hidroalcohólico presentó MIC = 125 μg/ml, seguido de fracciones de DCM y Buoh con MIC = 500 μg/ml, caracterizando actividad moderada. A la vista de los resultados, la fracción AcOEt fue más activa en relación al extracto hidroalcohólico y a otras fracciones. Según estudios de Cechinel Filho y Yunes³⁰, esta fracción concentra un gran número de metabolitos secundarios, tales como flavonoides, taninos, saponinas, ácidos triterpénicos y compuestos fenólicos, incluyendo hidroquinona²⁴. Sin embargo, se cree que algunos de los metabolitos secundarios concentrados en la fracción AcOEt pueden estar contribuyendo a la mejor actividad. Por otra parte, el alto rendimiento de esta fracción puede ser un dato interesante para estudios posteriores³⁹. En estudios in vitro, citados por Blumenthal et al.⁴⁰, se ha demostrado que los preparados a base de A. uva-ursi también tienen actividad antibacteriana frente a Proteus vulgaris, E. coli, U. urealyticum, M. hominis, S. aureus, P. aeruginosa, Enterococcus faecalis y Candida albicans.

En relación a la especie P. niruri, la fracción AcOEt presentó actividad antibacteriana moderada, con valores de CIM = 250 µg/ml, frente a la cepa M. genitalium. Contra S. aureus, las fracciones DCM y AcOEt presentaron actividad antibacteriana moderada, con CIM = 250 µg/ml y 500 µg/ml, respectivamente. P. niruri ha demostrado actividad antibacteriana in vitro contra Staphylococcus, Micrococcus y Pasteurella, bien como actividad antimalárica in vivo. Otras especies del género, como P. burchellii y P. parvulus, mostraron actividad contra E. coli, P. mirabilis, P. aeruginosa, Klebsiella oxytoca, Serratia marcescens y Bacillus subtilis (CIM ± 5 mg/ml)¹⁸. En un estudio realizado por Sumathi y Parvathi⁴¹, el CIM del extracto de las hojas de P. niruri fue de 50 μg/ml frente a Salmonella enterica sorovar Typhi y S. aureus, resultados que justifican el uso popular de esta planta para el tratamiento de la gastroenteritis. La actividad antimicrobiana de los extractos etanólicos y acetónicos de P. niruri también fue probada por el método de difusión de disco por Divya et al.⁴², que mostró zonas de inhibición efectiva de extractos contra aislados de Staphylococcus sp., E. coli, Pseudomonas sp. y Bacillus sp. Este resultado se debe a la presencia de taninos, flavonoides y compuestos fenólicos encontrados en la especie vegetal⁴². El etanol extracto de las hojas de P. niruri mostró alta actividad contra K. pneumoniae (18 mm), P. aeruginosa (16 mm) y P. mirabilis (26 mm), siendo este último superior al control positivo (23 mm)⁴³.

P. major presentó valores de MIC inactivos contra las cepas probadas. Los resultados obtenidos para la especie son similares a los reportados en la literatura, ya que la evidencia de actividad antimicrobiana sólo fue posible en extractos con alta concentración de compuestos bioactivos. Metiner et al.⁴⁴ analizaron la actividad antimicrobiana, utilizando el método de microdilución, y verificaron que el extracto acetónico era inactivo contra Bacillus cereus, con MIC = 3.562 μg/ml, así como contra las cepas de B. subtilis, P. mirabilis, P. aeruginosa y Staphylococcus epidermidis, con MIC = 28.500 μg/ml. El extracto etanólico también fue inactivo contra E. coli y B. cereus con MIC = 12.500 μg/ml. En los estudios de Okmen⁴⁵, el extracto metanólico de P. major fue inactivo (MIC = 1.625 μg/ml) contra diferentes cepas de S. aureus.

El análisis cromatográfico mostró que la especie A. brasiliana presenta un metabolito con Rf similar al β-sitosterol (Rf = 0,17) en las fracciones DCM y AcOEt, con Rfs ~ 0,18, como se muestra en la figura 1A. En la composición de esta especie, se destacan los fitoesteroles, como el estigmasterol, el β-sitosterol y el espinaterol. Tales sustancias se encuentran comúnmente en verduras, y el estigmasterol y el β-sitosterol son los esteroides principales presentes en membranas celulares de la planta. Estudios previos realizados con el β-sitosterol han demostrado un efecto analgésico y antiinflamatorio significativo³². En la figura 1B no se observó la presencia de compuestos activos similares al ácido gálico (Rf = 0,56) y al ácido clorogénico (Rf = 0,11), utilizados como patrones en las muestras analizadas. Otros estudios demuestran la presencia de compuestos fenólicos⁴⁶ y flavonoides⁴⁷,compuestos conocidos por su efecto antibacteriano⁴⁸.

Romm et al.²¹ sugirió que la actividad antimicrobiana de la especie A. uva-ursi está relacionada con la presencia de arbutina y su aglicona, hidroquinona. Además, según la Farmacopea Brasileña IV²², estos compuestos son considerados estándares de calidad para la identificación de esta especie. Sin embargo, de acuerdo con el perfil cromatográfico mostrado en las figuras 1C y 1D), no fue posible observar la presencia de compuestos similares a la hidroquinona/Rf = 0,40 y la arbutina/Rf = 0,24 en las muestras analizadas. Esta planta destaca por su alto contenido en glucósido de fenoles simples, siendo el principal la arbutina, cuyo contenido oscila entre el 6 y el 10%⁴⁸. Braz et al.²⁴ se demostró la presencia de hidroquinona en la fracción AcOEt de A. uva-ursi mediante CCD y en las mismas condiciones del presente estudio.

El bajo contenido o ausencia de estos compuestos en las especies vegetales analizadas puede atribuirse, por ejemplo, a la época del año en que se recogió la planta, a los procedimientos de secado y almacenamiento⁴⁸, o incluso por un posible intercambio de especies. Esta última hipótesis fue descartada, ya que la autenticidad de la especie fue confirmada por parámetros de la Farmacopea Brasileña IV²². Otra hipótesis puede estar relacionada con la estabilidad de los compuestos fenólicos, que son fácilmente oxidables tanto a través de enzimas vegetales específicas, como por la influencia de la luz y el calor. La hidroquinona, por ejemplo, es un compuesto fácilmente fotodegradable y presenta alta reactividad química, y puede sufrir oxidación, dependiendo de las condiciones de temperatura, pH y presencia de oxígeno en el medio, además de las formas de almacenamiento, que no se presentan en muestras adquiridas comercialmente^48,49. Además, se enfatiza la sensibilidad del método como factor de interferencia. En el análisis por CCD, los compuestos identificados suelen presentarse en mayor cantidad en los vegetales (mayoría). Las técnicas analíticas más sensibles pueden ayudar a detectar compuestos en las minorías presentes.

La especie A. uva-ursi también se caracteriza por el alto contenido de taninos, derivados del ácido gálico, y su concentración puede ser superior al 10%⁴⁸. Por esta razón, también se investigó la presencia de este compuesto en las muestras, que, en la metodología utilizada (Cuadro 1), aparece en Rf = 0,12 (Figura1C). El análisis cromatográfico mostró que un metabolito similar al ácido gálico está presente en el extracto hidroalcohólico, en la fracción DCM y AcOEt, y puede ser uno de los factores responsables de la actividad antibacteriana evidenciada en la presente muestra. Además, no hubo presencia de compuestos similares al ácido clorogénico (Rf= 0,55) y al ácido salicílico (Rf= 0,74), compuestos conocidos por su acción antiinflamatoria y bacteriostática²¹ (Figuras1E y 1F, respectivamente).

El perfil cromatográfico de P. niruri se muestra en la (Figura 1G). Los resultados revelaron la presencia de un metabolito similar al ácido gálico (Rf = 0,73) en las fracciones AcOEt y BuOH, lo que puede haber contribuido a la actividad moderada evidenciada contra M. genitalium. El análisis fitoquímico de esta planta, en estudios previos, registró la presencia de varios flavonoides, triterpenos, lignanos, fenoles y taninos. Sin embargo, todavía existen pocos estudios que correlacionen la actividad de las plantas con una sola sustancia o al efecto sinérgico entre los diferentes constituyentes^17,18.

Los resultados del perfil cromatográfico de P. major se muestran en la (Figura 1H). Es posible verificar una tinción similar al patrón de ácido clorogénico (Rf = 0,42), sugiriendo la presencia del metabolito en el extracto hidroalcohólico y en la Fracción AcOEt. Braz et al.²⁴ evidenciaron la presencia de ácido clorogénico y ácido cafeico en la Fracción AcOEt de P. major.

Debido a los pocos informes en la literatura sobre la acción de las plantas medicinales contra las especies molicutes y la búsqueda de mejores resultados frente a bacterias con pared celular, los datos encontrados pueden ayudar a obtener moléculas farmacológicamente activas y dilucidar el uso de plantas con fines terapéuticos, así como la Fracción AcOEt de A. uva-ursi, que presentó una excelente actividad antibacteriana (31,25 μg/mL) frente a la cepa de S. aureus.

CONCLUSIÓN

No fue posible establecer una relación estrecha entre el uso popular, la actividad antibacteriana in vitro y el perfil fitoquímico de las plantas, una vez que los efectos antibacterianos de las especies vegetales estudiadas variaron frente a las diferentes especies de bacterias, y, en la mayoría de los casos, fueron considerados inactivos. Los resultados de este estudio destacaron que la especie A. brasiliana, a pesar de ser conocida popularmente como "penicilina", un potente antibiótico de la clase de los β-lactámicos, no tiene cualquier actividad antibacteriana contra las cepas probadas in vitro.

Otro resultado relevante fue que la fracción AcOEt, obtenida de A. uva-ursi, demostró una excelente actividad contra S. aureus, lo que, según datos de la literatura, debería estar relacionado a la presencia de compuestos como arbutina e hidroquinona. Sin embargo, en el análisis cromatográfico, los compuestos no se encontraron, sugiriendo, así, la existencia de más compuestos responsables por esa actividad.