INTRODUCCIÓN

La industrialización y el crecimiento desenfrenado de las actividades asociadas a la agricultura y al comercio ha generado consecuencias perjudiciales para la salud humana y ambiental. Diversos estudios evidenciaron la presencia de residuos de sustancias químicas en los alimentos, en las aguas, en el suelo y en diversos organismos, debido al uso indiscriminado de agrotóxicos, que poseen propiedades bioacumulativas^1,2,3,4.

Datos del Sistema Nacional de Información Tóxico-Farmacológica (Sinitox) mostraron casi 30.000 casos de personas intoxicadas por plaguicidas, en el periodo de 2007 a 2014, equivalentes al promedio de ocho intoxicaciones diarias. La mortalidad fue de 0,26% (78/30.000 casos)^5,6. Con la actualización de los datos, en 2017, se producía un aumento significativo tanto en el número total de casos (76.115) como en la intoxicación media diaria (unos 18), pero con la mortalidad en el mismo nivel⁵. En 2019, el gobierno brasileño liberó más de 200 tipos de pesticidas, de los cuales el 43% son altamente tóxicos⁷.

Los pesticidas se pueden agrupar en dos categorías: químicos o biológicos, según la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos. Entre la categoría de químicos se encuentran organofosforados, carbamatos, organoclorados, piretroides y dicarboxídos⁸. En este último se encuentra el producto de este estudio, que es de la clase de herbicidas selectivos de acción no sistémica del grupo químico ciclohexano dicarboximida, clasificación dicarboximida, cuyo mecanismo de acción se basa en la inhibición de la enzima protoporfirinógeno oxidasa. Tales herbicidas necesitan ser activados por la luz para promover la peroxidación de los lípidos, que producen especies reactivas de oxígeno y causan la muerte celular⁹. En Brasil, este compuesto se clasifica toxicológicamente como clase II y clase III en cuanto al potencial de peligrosidad ambiental y se utiliza para el control de malezas, como la cuerda de viola (Ipomoea grandifolia) y la hierba caliente (Spermacoce latifolia),en el cultivo de soja, porotos y algodón, y Richardia brasiliensis, en cultivos de maíz^10,11. Según la recomendación del fabricante, el herbicida con flumioxazin es peligroso para el medio ambiente y, según la clasificación de la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (International Agency for Research on Cancer)¹², está incluido en el grupo 3, por lo tanto, no carcinogénico para los seres humanos.

Por lo tanto, la preocupación con la exposición a estas clases de pesticidas se debe al hecho de que la mayoría de estos agentes son capaces de interactuar con el material genético de las células, causando lesiones que no son reparables. Esta acumulación de daño mutagénico causa daños genotóxicos que eventualmente conducen a la carcinogénesis¹³. Sin embargo, vale la pena mencionar que todos los agentes mutagénicos son genotóxicos y no todas las sustancias genotóxicas son mutagénicas, precisamente porque no todos son capaces de interactuar directamente con el ADN¹⁴. Tofolo et al.¹⁵ advirtieron de estos riesgos para la salud de los agricultores que están sujetos a la exposición a plaguicidas. Los profesionales de la industria agraria son los más expuestos a estos compuestos a la hora de manipular, diluir, preparar, aplicar y monitorear los cultivos; sin embargo, no solo estos, sino también los indirectamente expuestos, como los individuos que viven cerca de los cultivos y los miembros de la familia que entran en contacto con la ropa del profesional que hizo uso de pesticidas¹⁶.

Algunos ensayos de evaluación de genotoxicidad son capaces de detectar aberraciones cromosómicas, intercambio de cromátidas hermanas y micronúcleos, mientras que el ensayo cometa, que es una prueba complementaria, se utiliza para verificar el daño del ADN más específicamente^17,18. El bioensayo con Allium cepa utiliza la aparición de anomalías cromosómicas como uno de sus bioindicadores para analizar los efectos tóxicos, citotóxicos, genotóxicos y mutagénicos de un compuesto químico en las raíces de cebolla. Fiskesjö¹⁹ destaca el uso de diferentes sistemas vegetales en pruebas para determinar ciertos daños derivados de compuestos químicos. Entre las plantas, las especies del género Allium son las más utilizadas para estudios de los mecanismos básicos y determinación de los efectos de algunos agentes químicos. Aunque existen ciertas diferencias entre el metabolismo de vegetales y animales, la activación pro-mutagénica en plantas tiene una alta relevancia, ya que los humanos estamos continuamente expuestos a estos riesgos al consumir vegetales tratados con agentes químicos²⁰. Dentro de este género, la Royal Swedish Academy of Sciences cuenta con la especie A. cepa como organismo modelo²¹, además de ser considerado el estándar oro en la evaluación de efectos clastogénicos y aneugénicos sobre material genético²².

El compuesto elegido como control positivo en este estudio fue el benzoato de sodio al 1%^23,24,25. Un estudio evaluó el potencial citotóxico del glutamato monosódico y el benzoato de sodio al 1% por A. cepa y observó toxicidad celular al reducir o incluso inhibir el crecimiento de las raíces y causar daño celular. El mismo estudio mostró que el estrés en las raíces fue mayor en el tratamiento con benzoato de sodio 1%, evidenciado por la diferenciación celular temprana²⁶. Este compuesto se utilizó como control positivo del efecto de citotoxicidad y ayudó en la validación de la técnica en relación con la exposición de los bulbos a sustancias distintas de las probadas.

Las pruebas que utilizan A. cepa tienen bajo costo y se pueden realizar en un corto período de tiempo, ayudando en estudios de prevención y control de daños al medio ambiente¹⁹. Además, también se destacan porque tienen alta sensibilidad y buena correlación con otros sistemas de ensayo, siendo posible realizar varias exposiciones al mismo compuesto con fines de monitoreo. Son pruebas fáciles que presentan un rápido crecimiento de las raíces, además de la facilidad en el análisis, al generar un gran número de células en división^22,26.

Debido a la relevancia de investigar los posibles efectos del uso de plaguicidas y los riesgos para la salud humana, el objetivo de este estudio fue investigar el potencial genotóxico de un herbicida con flumioxazina mediante el bioensayo A. cepa en dos concentraciones diferentes.

MATERIALES Y MÉTODOS

El presente estudio se desarrolló siguiendo protocolos adaptados de Krüger²³, y Aiub y Felzenswalb²⁴.

RESULTADOS

ANÁLISIS MACROSCÓPICO DE LAS RAÍCES

El análisis macroscópico se realizó de forma descriptiva en relación al número, tamaño (Tabla 1) y aspecto de las raíces.

Tabla 1 - Mediana y desvío estándar de los grupos control y prueba, de acuerdo con el número de raíces de cada bulbo de A. cepa y el tamaño, en cm, de las tres mayores 

	Grupos	Número de raíces	Tamaño (cm)
	Control negativo	25 ± 3,46 (mín. = 21; máx. = 27)	1,05 ± 0,08
	Control positivo	18 ± 5,30 (mín. = 14; máx. = 24)	0,32 ± 0,01
	Flumioxazin 0,5 g/L	27 ± 12,10 (mín. = 9; máx. = 44)	1,23 ± 0,02
	Flumioxazin 1,0 g/L	31 ± 13,60 (mín. = 14; máx. = 68)	1,00 ± 0,03

mín.: Mínimo; máx.: Máximo.

En cuanto al aspecto, los bulbos tratados con CP mostraron inhibición en el crecimiento radicular (Figura 1A). En el tratamiento con flumioxazina 0,5 g/L (Figura 1B) no hubo inhibición del crecimiento. Se observaron raíces endurecidas, oscuras y retorcidas, bien como la presencia de necrosis en las puntas, en ambas concentraciones de herbicidas (Figuras 1B y 1C).

Fotos: Lais Gonçalves Parvan.

A: Inhibición del crecimiento radicular tratada con benzoato de sodio al 1% (CP); B: Raíces tratadas con flumioxazina 0,5 g/L; C: Anomalías, como necrosis (flechas) y oscurecimiento de la raíz, observadas en ambas concentraciones de herbicidas.

Figura 1 - Bulbos de A. cepa luego de la completa exposición a la flumioxazina 

ANÁLISIS MICROSCÓPICO DE LAS RAÍCES

El efecto citotóxico de las cebollas se analizó calculando THE (Tabla 2), el efecto genotóxico por recuento de CA y el efecto mutagénico por recuento de micronúcleos. La citotoxicidad se calculó observando células en todas las fases del ciclo: profases, pre metafases, metafases, prefases, anafases y telofases²⁴.

Tabla 2 - Resultado de los valores del IM de cada grupo 

	Grupos	IM (media ± desvío estándar)
	Control negativo	0,0003 ± 0,0005 (mín. = 0; máx. = 0,0001)
	Control positivo	0,0036 ± 0,005 (mín. = 0,00008; máx. = 0,007)
	Flumioxazin 0,5 g/L	0,0033 ± 0,0037 (mín. = 0,00016; máx. = 0,012)
	Flumioxazin 1,0 g/L	0,0020 ± 0,0041 (mín. = 0; máx. = 0,01)

mín.: Mínimo; máx.: Máximo.

La frecuencia de AC fue presentada en la tabla 3. No se observaron AC en el grupo CN. El análisis microscópico de las raíces en las concentraciones test mostró AC como puentes anafásicos (Figuras 2A-B), anormalidades del huso (Figura 2C), metafase con quiebra cromosómica (Figura 2D), cromosomas vagantes (Figuras 2E-F), metafase anormal (Figura 2G), micronúcleos (Figura 2H) y células necróticas (Figura 2I).

Tabla 3 - Frecuencia de AC entre los grupos 

	Grupos	AC (media ± desvío estándar)
	Control negativo	-
	Control positivo	0,0002 ± 0,00021 (mín. = 0,00005; máx. = 0,00035)
	Flumioxazin 0,5 g/L	0,01 ± 0,01 (mín. = 0; máx. = 0,0002)
	Flumioxazin 1,0 g/L	0,00004 ± 0,00005 (mín. = 0; máx. = 0,00016)

mín.: Mínimo; máx.: Máximo; Señal convencional utilizada: - Dato numérico igual a cero, no resultante de redondeo.

Fotos: Lais Gonçalves Parvan.

Aumento de 40 veces. A-B: puente anafásico (flecha); C: anomalías del huso (flecha); D: metafase con quiebra cromosómica (flecha); E-F: cromosoma errante (flecha); G: fase anormal cumplida; H: micronúcleo (flecha); I: células necróticas.

Figura 2 - Células meristemáticas de A. cepa tratadas con flumioxazina en concentraciones de 0,5 y 1,0 g/L 

Los grupos CN y CP no presentaron micronúcleos en 1.000 células contadas. Las cebollas probadas en flumioxazina (0,5 g/L) presentaron un promedio de 0,1 ± 0,13 (mín. = 0; máx. = 0,4), mientras que las probadas en concentración 1,0 g/L presentaron un promedio de 0,3 ± 0,7 (mín. = 0; máx. = 0,2).

DISCUSIÓN

El herbicida con flumioxazina fue elegido porque es utilizado por agricultores de la región de la Zona da Mata, en el estado de Minas Gerais, principalmente en cultivos de soja y porotos¹². El estudio mostró que el herbicida, en ambas concentraciones probadas, era tóxico para las raíces al causar cambios en las células vegetales analizadas aquí, como necrosis en las puntas.

En el análisis microscópico, fue posible verificar que el herbicida con flumioxazina, a la concentración recomendada para su uso (0,5 g/L), presentaba signos de citotoxicidad. Además, se verificaron los efectos de la genotoxicidad en ambas concentraciones probadas, ya que causó AC en las células de cebolla.

Aunque se observaron micronúcleos en las concentraciones probadas, no se encontró significación estadística en comparación con los grupos CN y CP. Los micronúcleos pueden originarse espontáneamente, por lo tanto, se deben realizar más estudios para verificar su formación.

El hecho de que este herbicida presentara un efecto citotóxico y genotóxico muestra la importancia de monitorizar estas sustancias químicas y sus efectos sobre los organismos vivos, ya que los cambios provocados a nivel molecular afectaron directamente al material genético de la muestra analizada.

La prueba de A. cepa ya se ha utilizado en varios análisis, como en la evaluación de la genotoxicidad de fármacos²⁸, infusiones de plantas medicinales²⁹ y en la evaluación de la calidad del agua de río³⁰. Se trata de una prueba que, cuando sea necesario, puede complementarse con la prueba cometa en el análisis de fragmentación de ADN de las células, de forma que los efectos encontrados se asocien adecuadamente y se investigue su causa. Se sugiere que la prueba cometa se realice para complementar las pruebas de genotoxicidad, y que se agregue un mayor número de bulbos para los controles, para aumentar la potencia estadística en la comparación entre los grupos.

Krüger²³ y Leme y Marin-Morales²⁵ consideraron la inhibición del crecimiento radicular como un efecto tóxico. En el presente estudio, se analizaron dos factores para determinar la toxicidad: el cambio en el tamaño/número y la AC de las raíces. El efecto tóxico puede ser enmascarado por la presencia de macronutrientes inorgánicos (por ejemplo, nitrógeno y fósforo), lo que resulta en el alargamiento de las raíces de la cebolla³¹. Sin embargo, la determinación del efecto tóxico se basó en la presencia de AC, como necrosis, raíces distorsionadas y oscurecidas, observadas en el tratamiento con flumioxazina en ambas concentraciones.

Las plantas tienen mecanismos de autodefensa que pueden debilitarse cuando se exponen a situaciones de estrés ambiental. Por lo tanto, el uso excesivo de pesticidas, además de no siempre disuadir a las plagas, puede causar la aparición de enfermedades en las plantas. Así, el herbicida como agente estresor puede ser perjudicial para las raíces, provocando cambios radiculares y la muerte prematura de las mismas³².

La citotoxicidad se analizó mediante la determinación del IM, que se utiliza como biomarcador de proliferación celular midiendo la proporción de células divididas en las diversas fases del ciclo celular^25,33. El presente estudio identificó citotoxicidad a una concentración de 0,5 g/L al presentar diferencias estadísticamente significativas en el IM en comparación con el grupo CN. Tanto el aumento como la disminución de este índice indican citotoxicidad: el aumento sugiere un trastorno celular al causar la multiplicación de las divisiones celulares; y la reducción indica daño en el ADN, lo que lleva a una parada del ciclo celular en un intento de repararlo²⁵. Hubo una asociación del IM con el herbicida a una concentración de 0,5 g/L y la CN cuando se asoció con AC (p = 0,018), lo que sugiere que cuanto mayor el IM, mayor es el número de AC.

Cabe destacar que el aumento del IM puede estar relacionado con el aumento del tamaño de la raíz. Dos estudios encontraron el mismo efecto al analizar la citotoxicidad de las aguas de los ríos, señalando que cuanto mayor es el IM, mayor es el tamaño de la raíz^34,35. Asimismo, varios estudios lo han demostrado, observando que la disminución de este índice también causa inhibición del crecimiento radicular^23,35,36.

La presencia de AC se asoció con el efecto genotóxico. Las sustancias genotóxicas no siempre interactúan directamente con el ADN. Sin embargo, aquellas capaces de causar esta interferencia inducen daño al material genético en las células a través de interacciones con la secuencia y estructura del ADN. Estas anomalías cromosómicas en las células de A. cepa son un parámetro eficiente para la investigación del potencial genotóxico de los compuestos químicos, ya que proporcionan información que debe considerarse esencial en el proceso de carcinogénesis²⁵. Los agentes genotóxicos son capaces de actuar ampliamente sobre la célula, ya sea en la organización de sus orgánulos o de sus compartimentos, además de provocar cambios que pueden afectar al ciclo celular, desregular sus fases, generar células aberrantes e incluso inducirlas a la muerte³⁷.

El presente estudio sugirió el efecto genotóxico del herbicida con flumioxazina en las dos concentraciones probadas y también demostró la asociación entre el número de AC y IM. Es conocida la capacidad de los herbicidas de causar anomalías celulares. Las plantas de sorgo tratadas con el herbicida Atrazina mostraron un mayor número de cromosomas, células binucleadas y anomalías en las células madre del grano de polen, lo que demuestra la interferencia del herbicida en la estabilidad de la meiosis³⁸.

Los efectos clastogénicos (roturas de ADN) sobre las especies de Pisum sativum y A. cepa, inducidos por el tratamiento con herbicidas, también demuestran efectos de inducción a roturas cromosómicas en el ADN³⁹. Fernandes² consideró una acción aneugénica que impide la segregación simétrica del material genético durante la división celular, dando lugar a un desequilibrio genómico. A partir de los resultados de este estudio, es posible sugerir acciones aneugénicas debidas a la presencia de cromosomas errantes y cromosomas retardantes, es decir, que no fueron segregados correctamente, así como acciones clastogénicas, especialmente en muestras tratadas con benzoato de sodio al 1%, porque presentan esta acción conocida.

También fue posible observar la presencia de necrosis, a nivel microscópico, a una concentración de 1,0 g/L (Figura 2I), lo que puede explicarse por la respuesta de la célula al daño irreversible causado en el material genético⁴⁰. Diferentes mecanismos de mantenimiento de la homeostasis celular están vinculados al proceso de división celular, metabolismo celular y muerte celular. Las fallas en estos mecanismos debido a la falta de reparación pueden promover la transformación neoplásica y caracterizar el inicio del proceso de formación del tumor. Así, las células no regeneradas se refieren al proceso de muerte celular, también llamado necroptosis en patología, o necrosis celular programada, con el fin de evitar la activación de tumores⁴¹. Por lo tanto, es importante estudiar los factores y/o sustancias que pueden interferir en el ciclo celular, tal como se realiza en este estudio.

En la investigación de la mutagenicidad, el análisis se realizó mediante el conteo de micronúcleos. Existen divergencias en el concepto de mutagenicidad por parte de diferentes autores. Rudder y Marin-Morales²⁵ y Carvalho et al.²⁷ consideran la presencia de micronúcleos como parámetro de mutagenicidad, mientras que Krüger²³ y Fenech⁴² lo consideran como parámetro de genotoxicidad. Los micronúcleos se originan a partir de fragmentos cromosómicos acéntricos o se forman en células en división que presentan fragmentos cromosómicos completos que han interrumpido la capacidad de unirse al huso mitótico, es decir, no completan la migración anafásica de la división celular⁴². Esta característica indica la presencia de sustancias con efectos mutagénicos.

El presente estudio, a pesar de presentar células con la presencia de micronúcleos en las raíces tratadas con flumioxazina a las concentraciones probadas, no confirmó la mutagenicidad del compuesto porque no presentó significación estadística en comparación con el grupo CN y CP. La inducción de micronúcleos se utiliza, comúnmente, para detectar daños genotóxicos y mutagénicos resultantes de la exposición a agentes tóxicos. Sin embargo, los micronúcleos también pueden originarse espontáneamente⁴³ y pueden ser del orden de 3/1.000 células analizadas^42,44. Por lo tanto, el efecto mutagénico, debido a la presencia de micronúcleos en una sustancia probada, debe analizarse cuidadosamente.

En cuanto a los efectos genotóxicos, una revisión sistemática de publicaciones sobre el impacto del uso de plaguicidas en el medio ambiente, producidas en el período de 2011 a 2017, evidenció el daño causado por el uso de estas sustancias, a menudo al cambiar el hábitat natural de los ecosistemas⁴⁵. Estos riesgos no son solo para el medio ambiente, sino también para la salud humana, especialmente para los agricultores y manipuladores que son sometidos sucesivamente a la exposición a pesticidas. La falta de uso de protecciones adecuadas y el incumplimiento de los límites de concentraciones de uso permitidos por los organismos de control aumentan los problemas de salud y los daños ambientales¹⁵.

El mapa de uso de plaguicidas en los municipios del suroeste de Paraná mostró que la producción de commodities, como la soja, el maíz y el trigo, ha sido responsables del consumo exorbitante de plaguicidas en los municipios afectados, por lo que los principales principios activos utilizados desencadenan un alto riesgo de contaminación ambiental y también para la salud humana. El herbicida abordado en este estudio es ampliamente utilizado en Brasil en el control de malezas en estos cultivos⁴⁶.

Es importante conocer los efectos y posibles riesgos relacionados con la exposición excesiva a los pesticidas utilizados. Las pruebas de seguimiento de estas sustancias, ya sean las que indican el grado de exposición genotóxica de los individuos, como el bioensayo con A. cepa, o las que determinan los efectos de estos compuestos in vitro, son fundamentales a la hora de monitorizar las implicaciones futuras para la salud humana.

Las exposiciones excesivas a plaguicidas no solo se encuentran en alimentos que contienen residuos, sino también en el contacto de trabajadores rurales y familiares que, al manipular estos compuestos, se convierten en los más susceptibles a los daños. Uno de los problemas de las exposiciones sucesivas a estos herbicidas es el hecho de que conducen a una acumulación de mutaciones que, en un momento mayor, pueden causar cambios mutagénicos y cancerígenos. El desarrollo de cáncer no representa el único daño de la exposición a estas sustancias; también pueden ocurrir intoxicaciones agudas y crónicas. El uso de monitores ambientales para la evaluación de las actividades citotóxicas, genotóxicas y mutagénicas de los productos químicos ambientales, especialmente los plaguicidas, debe considerarse un indicador de riesgo potencial para la salud humana y el medio ambiente.

CONCLUSIÓN

El herbicida con flumioxazina, en ambas concentraciones, presentó efectos de toxicidad debido a las necrosis y anomalías observadas en sus raíces. La citotoxicidad se detectó en la concentración de uso, y la genotoxicidad se observó en las dos concentraciones probadas. No fueron constatados efectos mutagénicos.