CULTIVO E COLHEITA DE PLANTAS MEDICINAIS

Este estudo foi realizado entre março e dezembro de 2022 na Universidade Federal da Fronteira Sul (UFFS), campus Realeza, no estado do Paraná, Brasil.

As mudas de palmarosa (C. martinii) foram cultivadas em cinco linhas de 50 m de comprimento, com espaçamento de 1,5 m entre as plantas e de 1,5 m entre as linhas. O solo foi adubado semestralmente com 10 Mg ha⁻¹ de matéria orgânica proveniente de cama de aviário, sendo realizada uma adubação complementar após a poda (30 kg ha⁻¹). A colheita foi conduzida por meio de poda manual a cada 90 dias, durante o período de inflorescência.

O estudo contemplou coletas realizadas no outono (março a junho) e na primavera (setembro a dezembro), permitindo a avaliação da variação sazonal na produção do óleo essencial.

EXTRAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL, DENSIDADE RELATIVA E ANÁLISE CROMATOGRÁFICA

A massa vegetal fresca de palmarosa foi submetida à técnica de destilação por arraste a vapor para obtenção do óleo essencial. A densidade relativa do OEP foi realizada em triplicata pela divisão da massa pelo volume (densidade = massa/volume) a 20 ºC, conforme a metodologia ISO 279:1998¹⁵. O OEP foi analisado com cromatógrafo de fase gasosa Agilent MSD 5977, acoplado à espectrometria de massas.

CULTURAS, MICRORGANISMOS E PADRONIZAÇÃO DO INÓCULO

As estirpes de S. aureus (NP0038, NP0023, LB25923 e B24) foram oriundas do Laboratório de Pesquisas NB2 da UFFS, campus Realeza, Paraná.

As culturas previamente estocadas em ultrafreezer (-85 ºC) em caldo BHI (Brain Heart Infusion Broth) glicerinado (60%) foram reativadas e enriquecidas em BHI. Posteriormente, foram transferidas para caldo Mueller-Hinton e padronizadas para uma turbidez equivalente a 0,5 na escala de McFarland, correspondendo a 1,5 x 10⁸ UFC/mL.

DETERMINAÇÃO DA SUSCETIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS (TESTE DE DISCO-DIFUSÃO)

O teste de disco-difusão, também conhecido como antibiograma, foi realizado conforme a metodologia de Kirby-Bauer¹⁶ e preconizada pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)¹⁷. Esse teste tem como princípio básico a difusão do composto em teste na superfície de um ágar a partir de um disco impregnado com o mesmo, fornecendo resultados qualitativos ao categorizar as cepas bacterianas em suscetíveis, intermediárias ou resistentes¹⁸. É um método físico, onde o meio de cultura sólido contendo o microrganismo a ser testado é desafiado pela substância biologicamente ativa, formando um halo de inibição de crescimento do microrganismo¹⁹. Os seus resultados também são utilizados para orientar a terapia antimicrobiana adequada na clínica médica e veterinária²⁰.

Para tal, o inóculo com o microrganismo a ser testado foi padronizado em 0,5 na escala McFarland (1,5 x 10⁸ UFC/mL) e semeado em toda a extensão da placa contendo ágar Mueller-Hinton. Discos brancos estéreis com diâmetro de 6 mm obtidos comercialmente da empresa LB (Laborclin), contendo 10 μL do OEP, assim como os discos de controle positivo e negativo, foram alocados no meio de cultura, respeitando a distância adequada. O controle positivo foi realizado com discos PEN10 (penicilina G 10 UI) e TET30 (tetraciclina 30 μg); o controle negativo foi realizado com discos brancos estéreis contendo 10 μL de água destilada estéril. Para maior credibilidade, os testes foram executados em triplicata. A incubação foi realizada a 36 ºC durante 24 h. A leitura ocorreu por meio de um paquímetro digital (Vonder, Brasil) e comparada com valores padronizados em manuais^16,17 para indicação de cepas bacterianas sensíveis (halo de inibição > 8 mm), intermediárias (> 6 e ≤ 8 mm) ou resistentes (≤ 6 mm) ao OEP.

CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) E CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (CBM)

Para avaliar o efeito bacteriostático do OEP, verificou-se qual a concentração mínima do produto capaz de inibir o crescimento das quatro estirpes de S. aureus. A CIM é um parâmetro farmacodinâmico quase hegemônico, muitas vezes o único usado para projetar a antibioticoterapia²¹, sendo padronizado conforme as diretrizes do CSLI, com modificações²².

O teste foi realizado por meio de diluições seriadas, em que cada poço continha metade da concentração do OEP do poço anterior. Após as diluições e a pipetagem do inóculo ajustado a 0,5 na escala McFarland, a absorbância foi medida em espectrofotômetro na densidade óptica de 595 nm para a obtenção da absorbância inicial. Em seguida, as placas foram incubadas em estufa de crescimento microbiano durante 24 h a 36 ºC, com posterior leitura em espectrofotômetro com densidade óptica de 595 nm.

A CIM foi representada pela diferença na absorbância dos compostos testados (OEP, TET30 e PEN10) na leitura final, em comparação com a leitura inicial no espectrofotômetro. Tal diferença indica o crescimento e, consequentemente, a viabilidade da cepa. Para a confirmação da CIM, foi utilizado a resazurina como indicador de crescimento. Quando a resazurina (azul) não é reduzida à resorufina (rosa), fica constatado o efeito inibitório. Quando o corante sofre modificação para cor rosa, indica uma reação de oxirredução, evidenciando a viabilidade celular. A mudança de coloração do azul para rosa indica o crescimento bacteriano^23,24. Os procedimentos foram realizados em triplicata e o resultado foi obtido pela média aritmética simples.

Para avaliar o efeito bactericida do OEP, utilizou-se a CBM. Esta é a estimativa mais comum para avaliar a atividade bactericida e é definida como a menor concentração de um composto capaz de produzir 98,00-99,99% de efeito letal, quando comparado à população microbiana inicial²⁵. O teste de CBM foi realizado a partir dos poços onde não houve crescimento na CIM. Alíquotas com 10 μL foram semeadas em ágar Mueller-Hinton, seguido de incubação a 35 ± 2 ºC por 24 h (triplicata). Após a incubação, foram enumeradas as unidades formadoras de colônias (UFC). A concentração mais baixa na qual não houve crescimento bacteriano visível em ágar foi considerada CBM.

Para testar se houve diferença significativa da CIM e da CBM entre as quatro estirpes de S.  aureus, foi ajustado um modelo de regressão logística utilizando a função GLM (Generalized Linear Model) com distribuição binomial. Um modelo foi ajustado para cada variável resposta (CBM ou CIM) para cada um dos compostos (OEP, PEN10 e TET30). Os modelos incluíram como variáveis explicativas a concentração dos compostos, a estirpe e a interação entre estas. Para evitar viés em casos de separação completa ou quase-completa dos dados, situação comum em estudos microbiológicos com respostas binárias bem definidas para certos níveis dos preditores, foi empregado o método brglm.fit (Bias Reduction in Binomial-Response Generalized Linear Models), que realiza ajustes de redução de vieses.

A significância estatística de cada termo no modelo foi avaliada por meio de uma seleção backward, aplicando testes de razão de verossimilhança (qui-quadrado) para comparar o modelo completo com versões simplificadas, removendo um preditor de cada vez. Essa abordagem permite identificar se a exclusão de uma variável piora significativamente o ajuste do modelo. Em seguida, para comparar as diferentes respostas das estirpes, foram calculadas as médias marginais ajustando as comparações considerando o efeito da concentração como covariável. Realizaram-se comparações pareadas entre todas as estirpes com a função pairs, gerando contrastes com valores de p ajustados para múltiplas comparações. Os resultados foram sumarizados agrupando as estirpes que não diferiam estatisticamente entre si.

Para estimar o intervalo de confiança (IC) de 95% para a CIM e a CBM de cada composto sobre cada cepa, utilizou-se o pacote ciTools, com 1.000 simulações para estimação robusta da variabilidade sobre todo o range de concentração testada do composto. Em seguida, foi identificado o valor de concentração mínima para cada IC (limite conservador - IC 2,5%; mediana - IC 50%; e limite superior - IC 97,5%), considerando a menor concentração que apresentou probabilidade zero - indicando 100% de probabilidade de inibição ou morte da estirpe nesse intervalo.

Todas as análises estatísticas foram realizadas no software R, utilizando o nível de significância de alfa de 5%.

CARACTERIZAÇÃO DO OEP

O OEP apresentou maior rendimento na primavera (4,73 mL/kg) quando comparado ao outono (1,44 mL/kg), com densidade relativa de 0,88 g/mL. A análise química do OEP revelou oito compostos em ambas as estações climáticas, conforme descrito na tabela 1. Os componentes identificados foram: geraniol, acetato de geranila, linalol, cis-ꞵ-ocimeno, ꞵ-cariofileno e trans-ꞵ-ocimeno. Geranial e neral foram detectados apenas na amostra de primavera, enquanto ꞵ-mirceno e γ-terpineno foram encontrados exclusivamente na amostra de outono.

Em termos de composição percentual dos componentes químicos, o geraniol foi o composto majoritário tanto na primavera (63,07%) quanto no outono (64,53%). O acetato de geranila foi detectado em 24,48% no outono e em 21,59% na primavera, enquanto o linalol em 3,73% no outono e em 5,25% na primavera (Tabela 1).

CIM E CBM

Não houve efeito significativo da interação entre a concentração dos compostos e as cepas tanto para CIM quanto para CBM, indicando que todas as cepas tiveram o comportamento das curvas de resposta às concentrações iguais (Tabela 2). No entanto, houve efeito significativo das cepas tanto para CIM quanto CBM para todos os compostos, o que evidencia que as concentrações necessárias para inibição ou morte da estirpe são diferentes entre as cepas (Tabela 3 e Figura 1).

* As diferentes letras (a ou b) indicam agrupamentos significativos.

Figura 1 - Efeito antimicrobiano dos três compostos testados sobre as quatros cepas de S. aureus indicando as CIM e CBM com IC 95%* 

As análises complementares ( Tabela S1 ) mostraram diferenças significativas entre as estirpes, destacando as cepas LB25923 e NP0023, que apresentaram valores de CIM e CBM distintos dos demais isolados para todos os compostos testados.