INTRODUÇÃO

O uso disseminado de antibióticos ao longo dos anos favoreceu o surgimento de bactérias resistentes, uma vez que estas se adaptam com facilidade a diferentes ambientes considerados hostis. Muitos microrganismos patogênicos e de vida livre estão adaptados a habitats aquáticos, o que torna os rios potenciais reservatórios de genes de resistência a antibióticos (ARGs), especialmente naqueles sujeitos a intensa interferência humana¹.

Além disso, os níveis de ARGs têm demonstrado correlação com marcadores de águas residuais em rios fortemente impactados por atividades antrópicas, estando associados a patógenos humanos conhecidos e à sazonalidade do período chuvoso^2,3.

A variação sazonal da precipitação no estado do Pará caracteriza-se por um período chuvoso, que na maioria das localidades — como em Tucuruí — estende-se de dezembro a maio, e por um período seco, geralmente compreendido entre junho e novembro⁴.

Tucuruí abriga a segunda maior usina hidrelétrica (UHE) inteiramente brasileira e a quinta maior do mundo, com 4.214 km² de lago artificial que modificou profundamente o ecossistema regional, ocupando grande parte da floresta tropical nativa⁵. O reservatório possui cerca de 100 km de comprimento e 18 km de largura⁶, tendo submergido aproximadamente 14 aldeias ribeirinhas⁷. Sua construção estimulou debates sobre questões econômicas, sociais e ambientais, relacionadas ao desenvolvimento urbano e ao aumento da renda local, em contrapartida às perdas de produtividade agrícola e pesqueira^8,9.

O reservatório de Tucuruí está dividido em pelo menos dez estações que refletem diferenças morfométricas do sistema, influenciando diretamente a circulação e a vazão da água na região¹⁰. A população residente no entorno mantém uma estreita relação com o lago¹¹, no qual a atividade pesqueira desempenha papel de grande relevância econômica e social¹².

De acordo com o último Censo de 2022 do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística¹³, Tucuruí apresenta apenas 14,64% de esgotamento sanitário adequado. Assim como ocorre em grande parte das áreas urbanas e rurais da Amazônia brasileira desprovidas de infraestrutura sanitária¹⁴, é provável que efluentes oriundos de rejeitos humanos sejam lançados diretamente no lago da UHE Tucuruí — fenômeno intensificado durante o período chuvoso —, o que representa risco à saúde pública pela disseminação de bactérias portadoras de ARGs nesse ambiente.

Poucos estudos relacionam a presença de ARGs em ambientes aquáticos à sazonalidade local e, até o momento, não foram encontrados trabalhos que investiguem essa relação em lagos artificiais da Amazônia, o que reforça a relevância e o caráter inédito deste estudo.

Portanto, este trabalho teve como objetivo descrever a abundância e a diversidade de ARGs e avaliar seu potencial de disseminação de acordo com a variabilidade espacial e sazonal no lago da UHE Tucuruí.

MATERIAL E MÉTODOS

As amostras de água e sedimento foram coletadas no lago da UHE Tucuruí entre setembro de 2015 e março de 2017, período correspondente à execução do projeto matriz na região. Foram obtidos um litro da camada fótica (F), localizada a dois metros de profundidade a partir da superfície; um litro da camada afótica (A), correspondente ao fundo do lago; e 50 gramas da camada sedimentar (S), nas estações Montante 1 (M1) e Montante Novo Repartimento (MR) (Figura 1). As coletas ocorreram durante o verão amazônico (1), que compreende os meses de junho a novembro, e durante o inverno amazônico (2), entre dezembro e maio.

Figura 1 - Mapa da amostragem com a marcação da Usina Hidrelétrica Tucuruí e das estações estudadas 

Após a filtragem em membrana de nitrocelulose de 0,22 µm (Whatman, EUA), as amostras de ácido desoxirribonucleico (DNA) foram extraídas utilizando o kit UltraClean Microbial^® (Qiagen^®). O sequenciamento metagenômico foi realizado na plataforma Ion Proton^™ (Thermo Fisher Scientific), empregando fragment library.

As leituras foram submetidas ao FASTX-toolkit v.0.0.13 (-20/-l100/-q20/-p70)¹⁵ para controle de qualidade, e o SPAdes v.3.13.0¹⁶ foi utilizado para correção de erros de sequenciamento. A montagem de novo foi realizada com o MEGAHIT v.0.1¹⁷, e as open reading frames (ORFs) foram preditas pelo Prodigal v.2.6.3¹⁸.

Os ARGs foram identificados por meio da ferramenta Resistance Gene Identifier (RGI) v.5.2.0, a partir do banco Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) v.3.1.4¹⁹ (outubro de 2021), utilizando abordagem BLASTX com algoritmos "perfeito" e "estrito". Também foi utilizada a base MEGARes v.2.0.0²⁰ (14 de outubro de 2019), com abordagem TBLASTN. Os resultados obtidos foram mesclados e filtrados com identidade ≥ 80% e cobertura ≥ 40%.

A abundância (cobertura, ×/Gb) dos ARGs contidos em ORFs em cada amostra foi calculada conforme descrito por Ma et al.²¹, de acordo com a fórmula 1.

O arquivo ARG-carrying contigs (ACC) foi gerado para análises posteriores com o PATRIC v.3.6.12. A predição taxonômica foi realizada pelo Kraken2²² e a identificação de plasmídeos pelo PlasmidFinder v.2.1^23,24, utilizando os parâmetros: família Enterobacteriaceae, identidade ≥ 80% e cobertura ≥ 40%. Os plasmídeos identificados foram classificados quanto à mobilidade pela ferramenta MOB-Typer v.3.0.3²⁵. O SimpleSynteny v.1.5²⁶ foi empregado para determinar o arranjo entre ARGs e plasmídeos.

O heatmap foi gerado no Morpheus²⁷, e as análises estatísticas foram conduzidas no software R, com o pacote ggplot2²⁸, aplicando os testes de Kruskal-Wallis e Wilcoxon, adotando-se nível de significância de 95%.

RESULTADOS

Após a montagem de novo, foram identificados 4.453 genes de resistência a antibióticos (ARGs) contidos em open reading frames (ORFs), originados de 2.409 ARG-carrying contigs (ACCs) distribuídos entre as 12 amostras analisadas (Tabela 1). O perfil taxonômico revelou que os ARGs estavam predominantemente associados ao filo Proteobacteria, especialmente nas amostras M1F1, M1A1, M1F2, MRF2 e MRA2, com frequências superiores a 70%. As demais amostras apresentaram proporções semelhantes de Proteobacteria e do reino Terrabacteria, cada um com até 40% de ocorrência.

Os ARGs contidos em ORFs foram mais frequentes nas amostras M1F1 e M1A1 (Tabela 1) em comparação com as demais. No total, foram identificados 343 subtipos de ARGs, distribuídos em 25 tipos distintos. A maior diversidade de subtipos foi observada nas amostras da estação MR coletadas durante o inverno amazônico (χ²= 33,93; gl = 1; p-valor < 0,0001).

A Figura 2 apresenta a distribuição e a abundância dos diferentes tipos de ARGs nas amostras, com valores variando de 0,15 a 1.274,39 ×/Gb. Os tipos mais abundantes, considerando o conjunto total de amostras, foram: betalactâmicos (3.317,92 ×/Gb), macrolídeo-lincosamida-estreptogramina (MLS) (1.079,77 ×/Gb), tetraciclina (968,23 ×/Gb), aminoglicosídeo (779,25 ×/Gb) e genes de resistência a múltiplas drogas (698,94 ×/Gb).

M1: Estação Montante 1; MR: Estação Montante Novo Repartimento; F: Camada fótica; A: Camada afótica; S: Camada sedimentar; 1: Amostras coletadas durante o verão amazônico; 2: Amostras coletadas durante o inverno amazônico. MLS: macrolídeo-lincosamida-estreptogramina; *p < 0,05.

Figura 2 - Composição e abundância de diferentes tipos de genes de resistência a antibióticos nas amostras do lago da Usina Hidrelétrica de Tucuruí, estado do Pará, Brasil 

A soma de ranks no teste de Kruskal-Wallis indicou diferença altamente significativa na abundância total de tipos de ARGs entre as amostras (χ²= 64,01; gl = 11; p-valor < 0,0001). A amostra M1F2 apresentou abundância significativamente superior em relação à maioria das demais (teste de Wilcoxon: W ≥ 416,50; p-valor ≤ 0,03), exceto quando comparada às amostras MRF1 (W = 216; p-valor = 0,06), MRF2 (W = 361; p-valor = 0,35) e MRA2 (W = 336,50; p-valor = 0,64) (Figura 3).

Kruskal-Wallis rank sum test: χ² = 64,01; gl = 11; p < 0,0001. M1: Estação Montante 1; MR: Estação Montante Novo Repartimento; F: Camada fótica; A: Camada afótica; S: Camada sedimentar; 1: Amostras coletadas durante o verão amazônico; 2: Amostras coletadas durante o inverno amazônico; *p < 0,05.

Figura 3 - Comparação da abundância total de tipos de genes de resistência a antibióticos entre as diferentes amostras do lago da Usina Hidrelétrica de Tucuruí, estado do Pará, Brasil 

As amostras coletadas na camada sedimentar não apresentaram diferenças estatisticamente significativas entre si (W ≤ 296; p-valor ≤ 0,19), mas diferiram das demais amostras (W ≥ 406; p-valor ≤ 0,04) (Figura 3).

A abundância total de subtipos de ARGs de importância clínica (aqueles cuja administração ocorre ao menos uma dose diária²⁹), particularmente os relacionados aos tipos betalactâmico e multidroga-resistente, também diferiu significativamente entre as amostras segundo o teste de Kruskal-Wallis (χ²= 55,57; gl = 11; p-valor < 0,0001) (Figura 4). Observou-se maior incidência de betalactâmicos na camada fótica das estações M1 e MR durante o inverno amazônico (W ≥ 294; p-valor ≤ 0,04).

M1: Estação Montante 1; MR: Estação Montante Novo Repartimento; F: Camada fótica; A: Camada afótica; S: Camada sedimentar; 1: Amostras coletadas durante o verão amazônico; 2: Amostras coletadas durante o inverno amazônico; *p < 0,05.

Figura 4 - Comparação da abundância total de subtipos de genes de resistência a antibióticos clinicamente importantes, definidos como aqueles administrados em pelo menos uma dose diária, nas amostras do lago da Usina Hidrelétrica de Tucuruí, estado do Pará, Brasil 

A correlação entre ARGs e plasmídeos foi verificada nas amostras M1F1, M1A1 e MRF2 (Figura 5). Os genes bla _TEM-209 (1.164,50 ×/Gb), bla _TEM-95 (302,05 ×/Gb) e tetC (93,50 ×/Gb) foram encontrados em associação ao plasmídeo ColRNAI, indicando fortemente a possibilidade de transferência horizontal desses genes. A ferramenta MOB-Typer identificou que apenas o plasmídeo relacionado ao gene tetC na amostra MRF2 foi previsto como transferível.

M1: Estação Montante 1; MR: Estação Montante Novo Repartimento; F: Camada fótica; A: Camada afótica; S: Camada sedimentar; 1: Amostras coletadas durante o verão amazônico; 2: Amostras coletadas durante o inverno amazônico.

Figura 5 - Associação de genes de resistência a antibióticos com o replicon do plasmídeo ColRNAI e coassociação de ARGs, originando clusters em amostras específicas do lago da Usina Hidrelétrica de Tucuruí, estado do Pará, Brasil 

Também foi observada a ocorrência de clusters de ARGs, como o marRA (61,33 ×/Gb), que codifica fatores de transcrição associados à resistência a múltiplas drogas e foi identificado em M1F2; o kpnEF (9,61 ×/Gb), relacionado a bombas de efluxo de amplo espectro e detectado em MRF2; e o emrRA (48,41 ×/Gb), envolvido na regulação de bombas de efluxo associadas à resistência às fluoroquinolonas, encontrado em MRA2 (Figura 5).

DISCUSSÃO

De acordo com os dados apresentados neste estudo, a atividade humana contribui para a disseminação dos ARGs nos ecossistemas aquáticos. A poluição da água representa um problema urgente para os ecossistemas fluviais, principalmente em razão das atividades antropogênicas e da influência de efluentes domésticos e hospitalares. A compreensão da distribuição e transmissão dos ARGs tem sido utilizada como indicador da poluição e da pressão antrópica sobre os ambientes aquáticos^32,33.

O gene bla _TEM foi o betalactâmico mais prevalente nas amostras de água, independentemente da estação ou do período de coleta, resultado semelhante ao descrito por Yu et al.³⁴. O gene tetC também apresentou ampla distribuição entre as amostras, de modo consistente com o relatado por Jia et al.³⁵, que identificaram grande número de genes conferindo resistência à tetraciclina em um rio brasileiro e na microbiota intestinal de um peixe ornamental, destacando a necessidade de maior atenção à disseminação desses ARGs em ambientes antrópicos.

A elevada incidência do RNA ribossômico 23S resistente a macrolídeos (MLS23S), bem como dos genes rrsO e marRA, classificados, respectivamente, nos grupos MLS, aminoglicosídeo e multidroga-resistente, parece estar associada às amostras de água coletadas durante o inverno amazônico, conforme evidenciado em estudos prévios^36,37.

Durante o inverno amazônico observou-se maior diversidade de tipos de ARGs, demonstrando que o período chuvoso exerce influência determinante sobre a distribuição e a concentração desses genes. Essa tendência está de acordo com resultados obtidos em outras investigações realizadas em ambientes tropicais úmidos^2,3,38,39, que associaram o aumento da carga microbiana e da mobilização de ARGs aos eventos de precipitação intensa. Também foi demonstrada relação significativa entre marcadores de esgoto e ARGs em uma praia australiana³, bem como entre condições endêmicas, parâmetros físico-químicos e climatológicos e a abundância de ARGs em águas residuais de estações de tratamento na Colômbia³⁹.

Independentemente do período do ano ou do local de coleta, a abundância de ARGs nas amostras de sedimento não diferiu entre si, mas foi significativamente menor em comparação às demais amostras. Os ARGs mostraram-se mais diversos e abundantes nas águas superficiais do que nos sedimentos, achado semelhante ao descrito por outros autores^33,40. No entanto, difere do observado em um rio da Espanha, onde a ocorrência de ARGs nos sedimentos persistiu por longos períodos, independentemente da precipitação⁴¹. Segundo esses autores, a diversidade e a estabilidade dos ARGs podem ser influenciadas pelo microbioma e pelas condições físico-químicas do rio, associadas à descarga contínua de esgoto.

Além do sedimento como potencial reservatório secundário, a presença de biofilmes em superfícies bióticas ou abióticas, como microplásticos, merece atenção, pois constitui importante via de disseminação de ARGs⁴². Estudos recentes apontam que biofilmes podem apresentar até três vezes mais chance de carregar esses genes e favorecer sua associação com patógenos oportunistas, como bactérias do gênero Vibrio⁴³.

Os resultados de abundância dos subtipos de ARGs clinicamente importantes foram semelhantes à abundância total de tipos de ARGs em relação às amostras, com destaque para os betalactâmicos em M1F2, MRF2 e MRA2, indicando que sua ocorrência pode ser influenciada pelo período chuvoso. Achado semelhante foi relatado no rio Isabela, na República Dominicana, onde múltiplos genes betalactâmicos foram detectados em função da influência antrópica e da carência de infraestrutura sanitária⁴⁴.

A presença de ARGs — formando clusters ou não — associados ao replicon do plasmídeo ColRNAI representa forte evidência de transferência gênica horizontal. Essa correlação pode contribuir para a aquisição e disseminação desses genes, conforme demonstrado em estudos que identificaram a transferência de bla _KPC-2 e tetA em contextos semelhantes^32,45.

CONCLUSÃO

Os resultados deste estudo evidenciam a elevada diversidade e abundância de ARGs no lago da Usina Hidrelétrica de Tucuruí, influenciadas tanto pelo período chuvoso característico da região amazônica quanto pela precariedade do esgotamento sanitário no município. Esses achados reforçam a necessidade de monitoramento contínuo e de tratamento adequado de efluentes, a fim de reduzir riscos à saúde pública. Recomenda-se a realização de novos estudos que contribuam para mitigar os impactos à saúde humana e ambiental.