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Sensibilidade do teste ELISA anti-PGL-1 com dois antígenos sintéticos derivados do PGL-1 do Mycobacterium leprae

Sensitivity of ELISA anti-PGL-1 test with two derived synthetic antigens of PGL-1 of Mycobacterium leprae

Sensibilidad de la prueba ELISA anti-PGL-1 con dos antígenos sintéticos derivados del PGL-1 del Mycobacterium leprae

Maria do Perpétuo Socorro Amador Silvestre; André Brandão de Araújo; Gláucia Ferreira Barreto

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RESUMO

O diagnóstico da hanseníase é eminentemente clínico, porém a identificação do principal antígeno de parede celular do Mycobacterium leprae, o glicolipídeo fenólico 1 (PGL-1), contribuiu para estudos sobre a imunidade humoral na hanseníase. Este estudo experimental avaliou a sensibilidade do teste ELISA anti-PGL-1 utilizando-se dois glicolipídeos semisintéticos, dissacarídeo (ND-O-BSA) e trissacarídeo (NT-P-BSA) como instrumento potencial auxiliar para o diagnóstico da hanseníase. A sensibilidade/especificidade aos antígenos trissacarídeo e dissacarídeo foi, respectivamente, 97% e 98% e 83,3% e 96,1% comparando-se pacientes com hanseníase multibacilar (MB) e contatos consanguíneos (CCOS) mais contatos não consanguíneos (CNCOS). O antígeno trissacarídeo (NT-P-BSA) apresentou melhor desempenho no diagnóstico dos pacientes com hanseníase MB (p < 0,0001) comparado ao antígeno dissacáride (ND-O-BSA), o qual mostrou ser mais adequado para o diagnóstico de pacientes com hanseníase paucibacilar - PB (sensibilidade PB x CCOS = 80%). Além disso, o antígeno trissacarídeo mostrou-se mais adequado para vigilância epidemiológica de CNCOS (X² = 12.979, p = 0,0003). Em regiões endêmicas, o uso dos dois antígenos na sorologia da hanseníase é útil na análise de aspectos soroepidemiológicos relevantes para o diagnóstico e vigilância da hanseníase.

Palavras-chave: Hanseníase; Antígenos; Ensaio de Imunoadsorção Enzimática; Diagnóstico.

ABSTRACT

Keywords: Leprosy; Antigens; Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; Diagnosis.

RESUMEN

El diagnóstico de la lepra es eminentemente clínico, sin embargo, la identificación del principal antígeno de pared celular del Mycobacterium leprae, el glicolípido fenólico 1 (PGL-1) ha contribuido para estudios sobre la inmunidad humoral en la lepra. Este estudio experimental evaluó la sensibilidad de la prueba ELISA anti-PGL-1 utilizando dos glicolípidos semi-sintéticos, disacárido (ND-O-BSA) y trisacárido (NT-P-BSA) como instrumento potencial auxiliar al diagnóstico de la lepra. La sensibilidad/especificidad a los antígenos trisacárido y disacárido fue, respectivamente, 97,0% y 98,0% y 83,3% y 96,1% comparándose con pacientes con lepra multibacilar (MB) y contactos consanguíneos (CCOS) más contactos no consanguíneos (CNCOS). El antígeno trisacárido (NT-P-BSA) obtuvo un mejor desempeño en el diagnóstico de los pacientes con lepra MB (p < 0,0001) comparado al antígeno disacárido (ND-O-BSA), el que se mostró más adecuado para el diagnóstico de pacientes con lepra paucibacilar - PB (sensibilidad PB x CCOS = 80%). Además, el antígeno trisacárido se mostró más adecuado para la vigilancia epidemiológica de CNCOS (X² = 12.979, p = 0,0003). En regiones endémicas, el uso de los dos antígenos en la serología de la lepra es útil en el análisis de aspectos seroepidemiológicos relevantes para el diagnóstico y la vigilancia de la lepra.

Palabras clave: Lepra; Antígenos; Ensayo de Inmunoadsorción Enzimática; Diagnóstico.

INTRODUÇÃO

Hanseníase é doença milenar, causada pelo bacilo de Hansen, descoberto por Gerard Henrick Amauer Hansen em 1873. O diagnóstico da hanseníase é clínico. Entretanto, diversas técnicas laboratoriais têm sido propostas com objetivo de auxiliar no diagnóstico e classificar corretamente casos novos da doença para fins terapêuticos¹.

Na década de 1980 foi identificado o antígeno principal espécie-específico do Mycobacterium leprae, altamente imunogênico, denominado de glicolipídeo fenólico 1 (PGL-1). Desde que esse antígeno foi isolado e bem caracterizado, novos glicolipídeos foram produzidos com objetivo de se estabelecerem estudos da imunidade humoral na hanseníase. Estes antígenos são: a) monossacarídeo octil-BSA (M-O-BSA); b) dissacarídeo-BSA (D-BSA); c) dissacarídeo natural octil-BSA (ND-O-BSA); d) trissacarídeo natural fenol-BSA (NT-P-BSA) e, mais recentemente, o dissacarídeo natural octil-HSA (ND-O-HSA)^2,3.

O teste ELISA é uma técnica que exige estrutura laboratorial e pessoal treinado para sua realização, interpretação dos resultados e correlação com dados clínicos e epidemiológicos. Entretanto, o teste do fluxo lateral de leitura em 10 min (Ml Flow), o qual possui excelente concordância com o teste ELISA (85,9%, kappa = 70), é simples de ser executado, não necessita de pessoal treinado ou estrutura laboratorial, e é rápido e adequado para utilização em trabalhos de campo^{10,11,12,13,14}.

Embora o teste rápido, ou mesmo o ELISA, utilizando o antígeno PGL-1, tenha maior sensibilidade para o diagnóstico de pacientes com hanseníase multibacilar (MB) em virtude de avaliar a imunidade humoral, já se cogita a possibilidade de sensibilizar o teste Ml Flow com peptídeos e proteínas específicas do Mycobacterium leprae, as quais estimulam a produção de INFץ pelas células T(CD4), e essa possibilidade é promissora para aumentar significativamente a sensibilidade do teste para o diagnóstico da hanseníase MB e paucibacilar (PB). Parece óbvia a necessidade de se pensar em coletar sangue total com anticoagulante e estimular as células T(CD4) com os referidos peptídeos e proteínas específicas para, posteriormente, testar o sobrenadante na tira de nitrocelulose do teste Ml Flow^15,16,17.

A utilização de anticorpos monoclonais mostrou que a remoção do resíduo terminal da estrutura química do PGL-1 ocasiona a perda da ligação com a maioria dos anticorpos, comprovando que a síntese química do último dissacarídeo representa o epítopo antigênico específico a ser aplicado na sorologia para hanseníase^2,3,4,5,11.

Metas importantes estabelecidas pelo Ministério da Saúde para eliminação da hanseníase no Brasil são o diagnóstico precoce e a vigilância epidemiológica por meio do exame periódico de contatos, para que se tenha certo controle sobre focos de transmissão ativa da hanseníase em áreas endêmicas. Considerando a falta de um teste sensível e específico para o diagnóstico da hanseníase, é importante que seja possível utilizar os instrumentos disponíveis para viabilizar o diagnóstico precoce por meio do exame dos familiares de pacientes com hanseníase e, consequentemente, a descoberta de casos o mais precocemente possível, o que possibilita a quebra da cadeia de transmissão da doença em nosso meio^18,19,20.

Poucos artigos publicados avaliaram de forma comparativa o desempenho dos dois principais glicolipídeos semisintéticos do PGL-1, dissacáride (ND-O-BSA) e trissacáride (NT-P-BSA). Desta forma, este trabalho tem como objetivo avaliar o desempenho do teste ELISA anti-PGL-1 utilizando dois glicolipídeos semissintéticos como instrumento potencial auxiliar ao diagnóstico da hanseníase e classificação dos casos diagnosticados em MB e PB.

MATERIAIS E MÉTODOS

POPULAÇÃO

A amostra total deste estudo constou de 179 indivíduos, sendo 107 do sexo feminino (107/179 = 58,8%), com média de idade de 37,40 anos e 72 do sexo masculino (72/179 = 40,2%), com média de idade de 38,15 anos. Os indivíduos foram classificados nas seguintes categorias: a) contatos consanguíneos (CCOS), indivíduos que possuíam caso de hanseníase na família e conviveram mais de cinco anos com esta pessoa; b) contatos não consanguíneos (CNCOS), indivíduos que não possuíam nenhum caso de hanseníase na família; c) pacientes com hanseníase MB, pacientes com sinais e/ou sintomas compatíveis com as formas dimorfa ou virchowiana; d) pacientes com hanseníase PB, pacientes com sinais e/ou sintomas compatíveis com as formas indeterminada (I) e tuberculoide (T) virgens de tratamento ou com até três meses de tratamento poliquimioterápico, recentemente diagnosticados e notificados por médicos das Secretarias Municipais de Saúde (SMS) de Breu Branco, Cametá e Curionópolis, ao sudeste do Estado do Pará e encaminhados à equipe do Instituto Evandro Chagas (IEC). Projeto aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do IEC, Protocolo CEP/IEC/CAAE 0013.0072000-09 de 11/2011.

Os indivíduos do estudo foram divididos em: a) 30 pacientes MB (30/179 = 16,8%); b) 40 pacientes PB (40/179 = 22,3%); c) 51 CCOS (51/179 = 28,5%) e d) 58 CNCOS (59/179 = 32,4%), os quais foram examinados clinicamente e submetidos ao teste de sensibilidade cutânea em presença de máculas, manchas e lesões e/ou áreas hipoestésicas na pele, pela equipe do IEC e, após assinatura do Termo de Consentimento Livre e esclarecido, foram submetidos à coleta do material biológico, o qual foi centrifugado e acondicionado em tubos KMA, devidamente rotulados e congelados em nitrogênio líquido até a realização dos testes ELISA. Após o exame físico dermatoneurológico, foi preenchida a ficha epidemiológica padrão e estabelecida a classificação do indivíduo nos grupos citados.

O total de 179 amostras séricas foi submetido ao teste ELISA para pesquisar anticorpos da classe IgM contra PGL-1 do M. leprae utilizando-se separadamente os antígenos dissacáride (ND-O-BSA) e trissacáride (NT-P-BSA), conforme protocolo ligeiramente modificado, estabelecido pelo Laboratório de Hanseníase do IEC e o protocolo previamente estabelecido pelos estudos de Bührer-Sékula⁶.

De forma breve descrevemos o protocolo utilizado para uso do antígeno ND-O-BSA: o antígeno ND-O-BSA (25 µg/mL, 0,0041 µg/ mL) gentilmente cedido pela dr.^a Cristina Pessolani (FIOCRUZ), foi diluído com 25 µL de água Milli-Q esterilizada. Diluiu-se então 25 µL do antígeno em concentração de 1:4.000, em 100 mL de solução de carbonato/bicarbonato previamente preparada, pH = 9,61. Adicionou-se 100 µL do antígeno nas linhas A, C, E e G da placa de poliestireno de 96 poços de fundo chato e 100 µL da solução tampão nas linhas B, D, F e G. As placas (Nunc-Immunoplates - Life Technologies, Tasstrup, Denmark) foram incubadas overnight a 4°C por 24 h. Após essa incubação foram lavadas três vezes com 200 µL de solução tampão - PBST (Phosphate Buffer solution Tween-20), a 0,1% e bloqueadas com BSA 1% em tampão PBST por 1 h e 30 min a 37° C. Adicionou-se 50 µL de soro diluído com PBST a 10% NGS (1:300), ou seja, para cada 1,5 mL de PBST a 10% de NGS adicionou-se 5 µL de soro a ser analisado. As placas foram incubadas a 37°C por 2 h. Após lavagem com PBST três vezes adicionou-se 50 µL do conjugado anti-IgM-Peroxidadse (Cappel) previamente diluído (1:2.000) - para cada 10 mL de PBST a 10% de NGS acrescentou-se 5 µL do conjugado e adicionou-se 50 µL em toda a placa e, após incubação por 1 h a 37° C, as placas foram novamente lavadas com 200 µL de PBST quatro vezes, sendo bem enxugadas em papel toalha para procedimento de leitura, quando adicionou-se o substrato - TMB (Invitrogen), 50 µL, em toda a placa. A reação foi parada com 50 µL de ácido sulfúrico a 2,5 N e a intensidade da coloração foi determinada por meio da leitura da placa em 450/492 nm em leitor de ELISA. As placas foram incubadas em temperatura ambiente e no escuro por aproximadamente 30 min. Dependendo do substrato, este tempo varia bastante. A reação foi parada com a adição de 50 µL da solução de ácido sulfúrico 2,5 N de H₂SO₄ no soro padrão apresentou absorbância de 450 nm. Amostras consideradas positivas apresentaram média de absorbância ≥ 0,2 e as negativas ≤ 0,2.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Realizada com os software Epi-Info 2000 e BioStat 5.0²¹. Foram feitas análises univariadas (frequências) das variáveis: idade, sexo, classificação, BCG, positividade ao antígeno tri e dissacáride; análises bivariadas (tabelas) das variáveis: positividade x classificação (para os dois antígenos) e cálculo da razão de chances para pacientes MB x CCOC + CNCOS, pacientes PB x CCOS + CNCOS. Com a variável numérica "níveis de anticorpos IgM anti-PGL-1 di e trissacáride" foi feita análise pela Curva ROC da sensibilidade/especificidade e ponto de corte entre pacientes MB, PB e CCOS e CNCOS.

RESULTADOS

A tabela 1 mostra dados soroepidemiológicos, disponíveis em banco de dados do IEC, dos municípios estudados, usando-se a sorologia para pesquisa de anticorpos IgM contra PGL-1 do M. leprae pelo método ELISA, nos anos de 2006, 2009 e 2011.

Análise da sensibilidade/especificidade ao teste anti-PGL-1, pelo método da Curva ROC, utilizando-se antígeno semi-sintético trissacáride (NT-P-BSA) e dissacáride (ND-O-BSA) entre pacientes MB comparados aos indivíduos sadios, CCOS é mostrada na tabela 2.

A tabela 3 mostra análise da efetividade do teste ELISA anti-PGL-1 comparando-se o desempenho do teste com uso do antígeno di e trissacáride entre pacientes com hanseníase MB e PB e os indivíduos classificados como contatos de pacientes consanguíneos (CCOS) e não consaguíneos (CNCOS).

A positividade para o antígeno trissacáride e dissacáride entre pacientes com hanseníase PB e o grupo de indivíduos classificados como CCOS e pacientes PB x CNCOS, bem como o cálculo da sensibilidade/especificidade e ponto de corte pelo método da probabilidade condicional/ponto de corte Ayres et al²¹ é demonstrado na tabela 4.

As figuras 1 e 2 apresentam a sensibilidade/especificidade para IgM dirigidos contra PGL-1 do M. leprae para os antígenos NT e ND entre pacientes MB e CNCOS, comparando-se o desempenho dos dois antígenos.

DISCUSSÃO

Observou-se, neste estudo e com esta amostra, que o antígeno semissintético derivado do PGL-1 do M. leprae, dissacarídeo natural, apresentou melhor desempenho para o diagnóstico de pacientes com hanseníase PB, formas I e T, comparados aos pacientes MB, formas D e V (sensibilidade ao antígeno trissacáride para PB x CCOS = 80%) tabela 4. O antígeno trissacáride, por outro lado, apresentou melhor desempenho no diagnóstico e classificação dos pacientes com hanseníase MB comparados aos pacientes PB para o antígeno dissacarídeo (OR - MB x contatos = 103,38, p < 0,0001, IC95% 22,00 ≤ µ ≤ 485,68 e OR - PB x contatos = 0,387, p = 0,3482, IC95% - 0,0837 ≤ µ ≤ 1,804) tabela 3. Estudos que realizaram esta comparação^{10,11,12,13,14} são concordantes com o fato de que o antígeno dissacarídeo é mais específico e sensível que os outros antígenos, tais como: WML (Whole Mycobacterium leprae), a proteína total, o antígeno trissacarídeo natural e até o próprio PGL-1 nativo^{13,14,15,16,17}.

Os antígenos trissacarídeo e dissacarídeo possuem melhor desempenho para o diagnóstico dos pacientes MB comparados aos pacientes PB; a correlação dos níveis de anticorpos anti-PGL-1 é positiva na análise dos pacientes MB para os dois antígenos (p < 0,0001; tabela 3, figuras 1 e 2); ao contrário, a correlação dos níveis de anticorpos contra PGL-1 entre pacientes PB para os dois antígenos é negativa (p = 0,6750; tabela 3). Os estudos da imunidade humoral na hanseníase, em sua maioria observam sensibilidade de 90 a 100% para o diagnóstico da hanseníase MB e de 40 a 60% para o diagnóstico da hanseníase PB^3,4,5,6,7.

Por outro lado, o antígeno trissacarídeo parece ser mais adequado para a vigilância epidemiológica de CNCOS infectados com M. leprae, positivos ao anti-PGL-1, porém sem sinais clínicos compatíveis com hanseníase, comparados aos CCOS (X² = 12.979; p = 0,0003). Associação mais fraca foi observada para o antígeno dissacarídeo, de acordo com a mesma comparação supracitada (X² = 4.608; p = 0,03). Do ponto de vista epidemiológico, os CCOS podem ser classificados como contatos intradomiciliares e os CNCOS, como contatos extradomiciliares ou comunitários; em regiões consideradas hiperendêmicas observa-se, entre os CNCOS, maior proporção de indivíduos infectados, sem sinais clínicos, positivos ao teste anti-PGL-1, fato que sugere que a transmissão da hanseníase é difusa e ocorre mais na comunidade do que no interior do domicílio^3,4,5,6,7.

A taxa de soropositividade ao teste IgM-ELISA anti-PGL-1 entre contatos de pacientes com hanseníase, nesta amostra, foi 16,51% (18/109); entre CNCOS ou extradomiciliares, para o antígeno trissacarídeo foi 22,41% (13/58) e para o dissacarídeo foi 8,62% (5/58). Entre os CCOS ou intradomiciliares para o antígeno trissacáride foi 0% (0/51) e para o dissacáride foi 9,8% (5/51). A proporção de soropositividade entre contatos intradomiciliares de pacientes com hanseníase é variável de acordo com o grau de endemicidade da região estudada; Silva et al²⁴ observaram 6,9% de soropositividade para IgM-ELISA entre contatos intradomiciliares; Ferreira e Antunes²⁵ encontraram 19,7% entre contatos intradomiciliares em área endêmica; Barreto et al²⁶ encontraram 39% de soropositividade entre contatos intradomiciliares com PGL-1 nativo em área hiperendêmica; Bührer-Sékula et al⁶ encontraram 28,6% de soropositividade ao teste de leitura rápida Ml Flow com antígeno trissacarídeo em área hiperendêmica na Amazônia.

Neste estudo, observou-se que o antígeno trissacarídeo apresenta melhor desempenho na identificação de contatos de pacientes com hanseníase com maior risco de adoecimento por hanseníase comparado ao dissacarídeo, 22,41% e 8,62%, respectivamente (Tabela 2). A positividade geral entre contatos (CCOS + CNCOS) foi 16,51% (18/109), semelhante às taxas encontradas em outros estudos^{22,23,24,25,26}.

A especificidade da sorologia anti-PGL-1 observada por Oskam et al¹³ foi de 98%, exatamente igual a especificidade encontrada neste estudo (Tabela 2), na comparação entre pacientes MB e CCOS.

CONCLUSÃO

Os resultados encontrados neste estudo sugerem que o antígeno sintético dissacáride derivado do PGL-1 do M. leprae parece ter melhor desempenho para o diagnóstico dos pacientes classificados como PB (formas I e T) comparados aos pacientes MB (sensibilidade trissacáride PB x CCOS = 62,5%; sensibilidade dissacáride P x CCOS = 80%). Por outro lado, o antígeno trissacáride (NT-P-BSA) parece ter melhor desempenho no diagnóstico e classificação dos pacientes MB (formas D e V) comparados aos PB (OR MB x contatos = 103,38, p < 0,0001, IC95% - 22,0 ≤ µ ≤ 485,68 e OR PB x contatos = 0,387, p = 0,3482, IC95% - 0,0837 ≤ µ ≤ 1,8046).

O antígeno trissacáride desempenha melhor a vigilância epidemiológica dos indivíduos clinicamente sadios classificados como CNCOS, porém infectados, ou seja, positivos para PGL-1 comparado ao antígeno dissacáride. A utilização dos dois antígenos é importante para validar métodos sorológicos mais adequados às características soroepidemiológicas das regiões a serem estudadas.

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Correspondência / Correspondence / Correspondencia:

Recebido em / Received / Recibido en: 9/3/2012
Aceito em / Accepted / Aceito en: 10/8/2012