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Investigação sorológica, molecular e anatomopatológica para leptospirose em ovinos (Ovis aries) procedentes de um biotério de criação

Serological, molecular and pathological investigation for leptospirosis in ovines (Ovis aries) coming from a vivarium creation

Investigación serológica, molecular y anatomopatológica para leptospirosis en ovinos (Ovis aries) procedentes de un bioterio de cría

^ICentro Nacional de Primatas, Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil
^IISeção de Criação e Produção de Animais de Laboratório, Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil
^IIILaboratório de Investigação e Diagnóstico de Enfermidades Animal, Universidade Federal Rural da Amazônia, Belém, Pará, Brasil
^IVLaboratório de Investigação e Diagnóstico de Enfermidades Animal, Universidade Federal do Pará, Belém, Pará, Brasil
^VSeção de Bacteriologia e Micologia, Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Ananindeua, Pará, Brasil

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RESUMO

O presente trabalho relata um surto de leptospirose ocorrido no plantel de ovinos criados com finalidade de fornecimento de sangue aos laboratórios para produção de meios de cultivos e de testes de fixação de complemento. Foram realizadas análises sorológica, molecular e histopatológica. A análise sorológica foi realizada em 12 amostras utilizando o teste de soroaglutinação microscópica com ponto de corte 100, para os sorovares Leptospira Bataviae, L. Javanica, L. Panama, L. Hebdomadis, L. Castellonis, L. Icterohaemorrhagiae, L. Pyrogenes, L. Cynopteri, L. Serjoe, L. Australis, L. Wolffi, L. Copenhageni, L. Autumnalis, L. Pomona e L. Tarassovi. O exame anatomopatológico foi realizado somente em um dos animais, o qual foi encontrado morto e as análises moleculares foram realizadas no sangue e na urina utilizando a técnica do qPCR. Foram reagentes ao diagnóstico sorológico 50% dos animais, sendo identificados os sorovares L. Copenhageni (1/100 e 1/200), L. Castellonis (1/200 e 1/200), L. Icterohaemorrhagiae (1/200) e L. Cynopteri (1/200). O animal necropsiado apresentou hemorragia, icterícia e hemoglobinúria. A análise molecular demonstrou três animais positivos em amostras de sangue e dois animais positivos em amostras de urina, não havendo positividade concomitante para um mesmo animal. A identificação dos sorovares Icterohaemorrhagiae e Copenhageni sugere a necessidade de estudos, visando o isolamento do agente na região e a caracterização de sua patogenicidade, visto que no Brasil estes são os principais agentes etiológicos dos casos de leptospirose em humanos.

Palavras-chave: Leptospira; Ovinos; Biotério.

ABSTRACT

The current paper reports an outbreak of leptospirosis in sheep production created with the purpose of blood supply to laboratories for production of growth medium and complement fixation test. Serological, molecular and histopathological analyses were performed. Serologic analysis was performed on 12 samples using the microscopic agglutination test with cutoff point of 100 for the serovars: Leptospira Bataviae, L. Javanica, L. Panama, L. Hebdomadis, L. Castellonis, L. Icterohaemorrhagiae, L. Pyrogenes, L. Cynopteri, L. Serjoe, L. Australis, L. Wolffi, L. Copenhageni, L. Autumnalis, L. Pomona e L. Tarassovi. Anatomopathological examination was performed on only one animal, which was found dead and molecular analyzes were performed in its blood and urine using the qPCR technique. 50% of those animals were reagents to the serological diagnosis, being identified the serovars: L. Copenhageni (1/100 e 1/200), L. Castellonis (1/200 e 1/200), L. Icterohaemorrhagiae (1/200) e L. Cynopteri (1/200). The necropsied animal presented bleeding, jaundice and hemoglobinuria. Molecular analysis showed three positive animals in blood samples and two positive animals in urine samples, with no concomitant positivity for each animal. The identification of Icterohaemorrhagiae and Copenhageni serovars suggests the need for studies aiming the agent isolation in the Brazilian Amazon Region and characterization of its pathogenicity since in Brazil these are the main etiologic agents of leptospirosis cases in humans.

Keywords: Leptospira; Sheep; Vivarium.

RESUMEN

El presente trabajo relata un brote de leptospirosis que tuvo lugar en el plantel de ovinos criados con la finalidad de proveer sangre a los laboratorios para producir medios de cultivos y de pruebas de fijación de complemento. Se realizaron análisis serológico, molecular e histopatológico. El análisis serológico se hizo en 12 muestras utilizando la prueba de seroaglutinación microscópica con punto de corte 100, para los serovares Leptospira Bataviae, L. Javanica, L. Panama, L. Hebdomadis, L. Castellonis, L. Icterohaemorrhagiae, L. Pyrogenes, L. Cynopteri, L. Serjoe, L. Australis, L. Wolffi, L. Copenhageni, L. Autumnalis, L. Pomona y L. Tarassovi. El examen anatomopatológico se realizó en solamente uno de los animales, el cual fue hallado muerto y los análisis moleculares se hicieron en sangre y orina utilizando la técnica de PCR. Fueron reactivos al diagnóstico serológico 50% de los animales, siendo identificados los serovares L. Copenhageni (1/100 y 1/200), L. Castellonis (1/200 y 1/200), L. Icterohaemorrhagiae (1/200) y L. Cynopteri (1/200). En la necropsia el animal presentó hemorragia, ictericia y hemoglobinuria. El análisis molecular demostró tres animales positivos en muestras de sangre y dos animales positivos en muestras de orina, no surgió positividad concomitante para un mismo animal. La identificación de los serovares Icterohaemorrhagiae y Copenhageni sugiere la necesidad de estudios, con el objetivo de aislar el agente en la región y la caracterización de su patogenicidad, teniendo en vista que en Brasil estos son los principales agentes etiológicos de los casos de leptospirosis en humanos.

Palabras clave: Leptospira; Ovinos; Bioterio.

INTRODUÇÃO

A leptospirose é uma antropozoonose causada por bactérias do gênero Leptospira spp., que possui ocorrência em áreas urbanas e rurais. É uma doença que acomete o homem e a grande maioria dos animais domésticos e selvagens. Atualmente são conhecidas 14 espécies patogênicas, sendo a mais importante L. interrogans¹. São mantidas na natureza principalmente nos mamíferos, embora já tenham sido isoladas de répteis, anfíbios, peixes, pássaros e invertebrados. Estes animais podem se tornar portadores das leptospiras, albergando-as no aparelho urinário e eliminando-as pela urina para o meio ambiente, constituindo fonte de infecção para animais suscetíveis². Os principais reservatórios são os animais sinantrópicos domésticos e selvagens como Rattus norvegicus (ratazana ou rato de esgoto), Rattus rattus (rato de telhado ou rato preto) e Mus musculus (camundongo ou catita). Além de outros reservatórios de importância como os caninos, suínos, bovinos, equinos, ovinos e caprinos³. Segundo Ellis⁴, uma grande quantidade de informação tem sido publicada a respeito da doença em bovinos; porém pouco se sabe sobre a leptospirose nos pequenos ruminantes.

Os animais domésticos menos suscetíveis são os ovinos, no entanto, sofrem com a infecção das leptospiras, com evolução assintomática, em muitos casos, podendo, às vezes, ocorrerem surtos da doença com abortamento e até morte⁵.

Santa Rosa e Castro⁶ relataram pela primeira vez, no Brasil, a infecção por Leptospira sp. em ovinos no Estado de São Paulo, onde foi encontrada uma prevalência de 34%.

Diferentes métodos laboratoriais podem confirmar o diagnóstico, seja baseado na detecção de anticorpos, ou por métodos que revelam a presença do microrganismo ou do seu ácido nucleico^7,8,9. A Organização Mundial da Saúde (OMS) considera o teste de soroaglutinação microscópica (SAM) com antígenos vivos como padrão ouro para o diagnóstico da leptospirose¹⁰. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) permite amplificar quantidades mínimas de DNA de Leptospira spp. em diversos tipos de amostras biológicas^9,11. Alguns casos de leptospirose clinicamente aparentes em ovinos têm sido associados principalmente às sorovariedades Pomona¹², Ballum, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Sejroe¹³ e Hardjo⁴.

O único que pode utilizar tecidos formolizados é o exame histopatológico (renais, placentários, pulmonares, hepáticos em casos de aborto), possuindo como desvantagem uma baixa sensibilidade e incapacidade de detectar a sorovariedade infectante¹⁴.

O presente estudo relata um surto de leptospirose ocorrido no plantel de ovinos, criados com finalidade de fornecimento de sangue aos laboratórios para produção de meios de cultivos e de testes de fixação de complemento.

O estudo (parecer CEUA/IEC n° 001/2014) relata a ocorrência de surto de leptospirose na criação de ovinos do biotério da Seção de Criação e Produção de Animais de Laboratório do Instituto Evandro Chagas (IEC), órgão vinculado à Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde (MS). A criação ficava na proximidade de uma área de mata preservada e possuía em seu entorno uma área residencial, o que facilitou a atração de roedores, tanto silvestres quanto sinantrópicos, devido à disponibilidade de restos alimentares na área de criação.

Somente após a morte de um exemplar dos ovinos e de um abortamento no mês anterior ao óbito resolveu-se proceder às investigações clínicas e laboratoriais sobre a causa mortis e do abortamento dos animais, no entanto os outros exemplares eram clinicamente assintomáticos.

Os espécimes clínicos avaliados incluíram amostras de sangue (n = 12) e urina (n = 9) dos 13 animais suspeitos. O diagnóstico da enfermidade foi realizado por meio de análise sorológica, molecular e histopatológica; o teste de Soroaglutinação Microscópica (SAM) foi realizado conforme as recomendações do MS e da OMS^3,11. As amostras foram testadas com diluição variando de 1:100 até 1:6.400 e foram utilizados os seguintes sorovares para a prova de SAM: Australis, Autumnalis, Bataviae, Castellonis, Copenhageni, Cynopteri, Hebdomadis, Icterohaemorrhagiae, Javanica, Panama, Pomona, Pyrogenes, Sejroe, Tarassovi e Wolffi.

O DNA das diferentes amostras foi extraído com o kit comercial QIAamp^® DNA Mini Kits (QIAGEN, Austrália), de acordo com as instruções do fabricante. Alíquotas de 200 μL de água ultrapura foram usadas como controles negativos em cada procedimento de extração de DNA. Os ensaios de PCR quantitativa em tempo real (qPCR) foram realizados de acordo com Stoddard et al¹⁵, com algumas modificações. A detecção de leptospiras foi realizada pelo gene lipL32, presente apenas em espécies patogênicas, para amplificação do fragmento lipL32 (242 pb) foram utilizados iniciadores LipL32-45F (5'-AAGCATTACCGCTTGTGGTG-3') e LipL32-286R (5'-GAACTCCCATTTCAGCGATT-3'), em conjunto com a sonda de hidrólise LipL32-189P (5'-FAM-AAAGCCAGGACAAGCGCCG-MGB-3'). As amplificações foram realizadas no equipamento 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems^®), utilizando o sistema TaqMan^® PCR Master Mix (Applied Biosystems^®). As reações foram executadas em duplicata para testar a reprodutibilidade do teste. Um controle negativo (água) e um positivo (L. Icterohaemorrhagiae) foram incluídos em todas as corridas de amplificação.

O exame anatomopatológico pós-morte foi realizado somente em um único animal, o qual foi encontrado morto, procedendo com o registro descritivo e documentação cadavérica. Após ser necropsiado, o cadáver foi acomodado em saco plástico adequado e encaminhado para incineração. Devido ao seu estado de autólise post-mortem não foram colhidas amostras biológicas para realização de exames complementares.

RESULTADOS

De 13 animais testados, cinco (38,4%) foram positivos por meio do qPCR utilizando amostras de sangue e urina e seis animais dos 12 testados pela SAM (50%) reagiram para um ou mais sorovares da Leptospira spp. Dentre os animais soro reagentes, o sorovar Castellonis foi o mais frequente com três soros reagentes (1/200 - 25%), seguido pelo Copenhageni com dois soros reagentes (1/100 e 1/200 - 16,6%) e um soro reagente ao sorovar Icterohaemorrhagiae (1/200 - 8,3%) e um reagente ao sorovar Cynopteri (1/200 - 8,3%).

Um animal apresentou sororreatividade a dois sorovares, Castellonis (1/200) e Cynopteri (1/200). A análise molecular detectou três animais positivos em amostras de sangue (23%) e dois animais positivos em amostras de urina (22,2%), não havendo positividade concomitante em um mesmo animal entre os espécimes clínicos (sangue e urina) segundo a análise molecular (Tabelas 1 e 2).

Para o qPCR tivemos uma amostra (Animal 2) que apresentou "threshold cycle" (Ct) 20,06, porém ao SAM foi não reagente, uma segunda amostra (Animal 3) que apresentou Ct 24,21, porém a amostra encaminhada estava hemolisada e não foi possível realizar a SAM e uma terceira amostra (Animal 11) que apresentou Ct 28,40 e resultado ao SAM o soro reagente ao sorovar Copenhageni (1/200) (Tabela 3).

No exame anatomopatológico pós-morte, observou-se que o animal apresentava boa condição corporal, além de sangramento nasal bilateral (Figura 1), sangue fluindo pela cavidade nasal e fezes com sangue no orifício anal (Figura 2). No exame interno, iniciado a partir da incisão mento-pubiana e rabatimento da pele, foi evidenciado edema na região dorsal. A gordura do subcutâneo mostrou-se de coloração amarelada (ictérica) (Figura 3). Na abertura da cavidade torácica evidenciou-se pequena quantidade de líquido de aspecto translúcido; no coração observou-se hemorragias epicárdicas, já com embebição hemolítica (post-mortem). Na abertura da cavidade abdominal, o omento também possuía uma coloração amarelada (icterícia); o fígado estava bastante autolisado com coloração amarelo-acastanhado; o baço mostrou leve aumento de tamanho (esplenomegalia) e os rins uma coloração mais escurecida (congestão) (Figura 4). A bexiga apresentava baixo volume urinário com coloração escurecida (aspecto marrom escuro).

Os ovinos podem ser portadores e eliminadores da bactéria na urina por um tempo prolongado. Essa eliminação pode constituir um problema zoonótico para todos que entrarem em contato com o animal^16,17,18. A leptospirose é um problema ocupacional, pois pesquisas de isolamentos que foram conduzidas em diversos países têm demonstrado a importância dos ovinos na epidemiologia da doença, principalmente em relação à saúde pública^7,16.

Existem pesquisadores que apontam possíveis resistências dos ovinos à doença^5,19, porém outros relatam surtos de leptospirose aguda com perdas significativas, especialmente em animais jovens, caracterizados por febre alta, hemoglobinúria, anemia hemolítica, icterícia, hematúria e, em alguns casos, morte^12,18,20.

Houve a identificação dos sorovares Copenhageni e Icterohaemorrhagiae, que são os principais agentes etiológicos dos casos de leptospirose em humanos no Brasil, confirmando o papel do rato doméstico como o principal reservatório, uma vez que o Rattus rattus e o Rattus norvegicus são os reservatórios mais comuns desses sorovares³, destacando desta maneira a importância dos programas de controle de roedores junto à area de criação. Alguns inquéritos sorológicos realizados no Brasil encontraram esses dois sorovares como um dos mais frequentes^{9,21,22,23,24,25,26}.

O predomínio da reatividade ao sorovar Castellonis concorda com citações de outros autores²⁷ e demonstra que também foi um dos mais frequentes em ovinos^5,16,28,29.

Há escassas informações na literatura sobre a prevalência do sorovar Cynopteri em ovinos. Este sorovar foi identificado infectando ovinos de fazendas em outros países, como Portugal, nas Ilhas Antilhas, Itália e Sudão^{5,30,31,32,33}. No Brasil, Carvalho²⁴, detectou o sorovar em um estudo realizado durante abate em feiras livres no Município de Teresina, Estado do Piauí. No Estado do Pará pouco se conhece sobre a soroprevalência da leptospirose em ovinos.

Diferentemente de outros autores^{1,18,34,35,36} que afirmam que a leptospira sorovar Hardjo é uma das mais prevalentes nos plantéis e ou rebanho de ovinos, não houve a identificação deste neste estudo, mostrando que o diagnóstico de sorovares infectantes para ovinos pode variar dependendo da região.

As respostas sorológicas que foram observadas, podem significar exposição natural à infecção, visto que a vacinação não é preconizada na criação de ovinos utilizados em pesquisa biomédica.

As diferenças e os resultados encontrados em outros trabalhos podem ser atribuídos a fatores metodológicos como ponto de corte, modalidade de teste e coleção de antígenos empregados, todavia não se pode excluir a hipótese do aumento da disseminação de um determinado sorovar na dependência de fatores ambientais ligados ao manejo e a movimentação de animais²¹.

Um grande número de artigos publicados demonstra a utilidade da PCR em tempo real relacionada à área microbiológica³⁷. A PCR em tempo real é uma metodologia atrativa na substituição da cultura convencional e dos ensaios baseados em antígenos, devido sua elevada sensibilidade e especificidade, associada a um curto tempo para a liberação dos resultados e facilidade de realização da técnica. Além disso, é uma técnica capaz de quantificar o gene alvo produzido a cada ciclo.

São necessários o isolamento e identificação dos sorovares circulantes nos rebanhos e/ou plantéis, objetivando não somente avaliar sua adaptação e interação com as condições de manejo e ambiente, mas também para definir quais sorovares é mais prevalente em determinada região, investigar a patogenicidade e decidir a incorporação destes nas vacinas nacionais.

Com relação aos achados de necropsia têm-se as alterações macroscópicas que incluem graus variáveis de icterícia, hemorragia e anemia, além da presença de sangue na urina. Em alguns animais, os rins podem estar aumentados e com hemorragias petequiais na sua superfície¹⁰. Este fato ocorre devido à preferência que as leptospiras têm pelos rins, nos quais provocam lesões severas. Nas lesões renais túbulo-intersticiais são consideradas as alterações patológicas básicas da doença³⁵, no entanto, no presente estudo, não foi possível realizar a análise histopatológica dos tecidos, devido ao avançado estado autolisado dos mesmos.

CONCLUSÃO

Constatou-se que na criação 50% de animais eram reagentes à SAM, com a identificação dos sorovares Icterohaemorrhagiae e Copenhageni, o que sugere a necessidade de estudos visando o isolamento do agente na região e a caracterização de sua patogenicidade, uma vez que no Brasil estes são os principais agentes etiológicos dos casos de leptospirose em humanos.

A criação de animais de produção utilizados em pesquisa biomédica deve obedecer às recomendações de criação de animais de laboratório, para evitar entrada de animais invasores transmissores de patógenos como leptospiras. Sendo assim, optou-se pela eutanásia de todo o plantel.

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Correspondência / Correspondence / Correspondencia:
Liliane Almeida Carneiro ]]> Instituto Evandro Chagas/SVS/MS
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Recebido em / Received / Recibido en: 27/11/2014
Aceito em / Accepted / Aceito en: 3/12/2015