Avaliação histoquímica da mucosa gastrointestinal de ratos expostos ao álcool¹

Histochemical avaliation of the gastrointestinal mucosa of rats exposed to alcohol

Mario Ribeiro Melo-Júnior^I; Marcos Cezar Feitosa de Paula Machado^II; Jorge Luiz Silva Araújo-Filho^III; Vasco José Ramos Malta Patu^IV; Eduardo Isidoro Carneiro Beltrão^V; Nicodemos Teles de Pontes–Filho^VI.

^IProfessor titular de Patologia – ASCES, Doutorando em Ciências Biológicas – CCB/UFPE
^IIMestrando em Patologia – CCS/UFPE ]]> ^IIIMestre em Patologia – CCS/UFPE
^IVMestrando em Ciências Biológicas – CCB/UFPE
^VProfessor adjunto do Departamento de Bioquímica – CCB/UFPE, Doutor em Ciências Biológicas
^VIProfessor adjunto do Departamento de Biologia – UFRPE, Doutor em Nutrição

Endereço para correspondência

RESUMO

OBJETIVO: avaliar através da histoquímica com lectinas a expressão de glicosaminoglicanos (mucinas) nas células do trato gastrointestinal de ratos expostos ao etanol.
MÉTODO: ratos foram expostos ao etanol (3g/kg do peso) durante 15, 30 e 45 dias. Após a perfusão, o estômago e o intestino fixados em formalina tamponada a 10% e fragmentos desses órgãos emblocados em parafina. Os cortes histológicos (4µm) foram incubados com lectinas (PNA, WGA e Con A) conjugadas à peroxidase. A marcação das lectinas se revelou com o DAB–H2O2, seguida pela contra–coloração com hematoxilina. Os métodos Periodic acid–shiff (PAS) e Alcian blue foram usados para avaliar a expressão de glicosaminoglicanos (mucinas). ]]> RESULTADOS: verificou–se que na mucosa gástrica a expressão das mucinas aumentou progressivamente durante a exposição ao etanol, conforme o aumento do número de células PAS e Alcian blue positivas. Por outro lado, na mucosa intestinal nenhuma diferença considerável se observou no número dessas células. Todas as lectinas testadas apresentaram um aumento no padrão de marcação relacionado ao maior período de exposição ao etanol. A PNA foi a mais seletiva das lectinas, reconhecendo, exclusivamente, células do cólon e das glândulas gástricas. A Con A apresentou uma intensa marcação nas regiões apicais das glândulas do cólon e do estômago, enquanto que a WGA reagiu, intensamente, nas células caliciformes e células de Paneth nas glândulas do epitélio intestinal.
CONCLUSÃO: esses achados demonstram que a exposição ao etanol, leva a uma alteração dos padrões de reconhecimento das lectinas nas células do tecido gastrointestinal, bem como, um aumento a expressão gástrica das mucinas.

Descritores: Histoquímica, lectinas, etanol, glicosaminoglicanos

SUMMARY

OBJECTIVES: in this work, lectin histochemistry was used to evaluate the expression of glycosaminoglycan (mucin) in gastrointestinal cells of rats exposed to ethanol.
METHOD: Rats were exposed to ethanol (3g/kg of weight) during 15, 30 and 45 days. After perfusion, the stomach and intestine were formalin 10% fixed and the tissues were paraffin embedded. Slices (4mm) were incubated with peroxidase–conjugated lectins (PNA, WGA and Con A). Lectin staining was revealed with DAB–H2O2 followed by haematoxylin counterstaining. Periodic acid–Shiff (PAS) and Alcian Blue staining methods were used to evaluate glycosaminoglycan expression.
RESULTS: indicated that, in gastric mucosae, acid and neutral mucin expression rose progressively during ethanol exposition while in intestinal mucosae no considerable difference was observed in the number of PAS– and Alcian Blue–positive staining cells. All lectins presented an increasing binding pattern related to the period of ethanol exposure. PNA was the most selective lectin, recognizing exclusively colon cells and gastric glands. Con A presented an intense binding to the bottom region of the colon stomach glands while WGA intensely bound to the caliceform and Paneth cells in the intestinal glands.
CONCLUSION: These findings demonstrate that ethanol exposure led to a different pattern of lectin recognition of the cells of the gastrointestinal tissue.

Keywords: Histochemistry, lectins, ethanol, glycosaminoglycans

INTRODUÇÃO

Um dos principais locais de ação tóxica do etanol nas células é a membrana plasmática. Vários estudos têm demonstrado a existência de correlações entre o nível de intoxicação e a extensão de desordens na membrana celular resultante da ação do etanol¹. A ingestão de álcool afeta as membranas plasmáticas e organelas celulares devido no metabolismo de lipídios, carboidratos e proteínas, predispondo os tecidos às injúrias.

Alterações morfológicas e funcionais do trato gastrointestinal após a exposição ao etanol têm sido descritas em humanos² e animais experimentais³, caracterizando–se, essencialmente, pela interferência nas células epiteliais e na manutenção da flora microbiana residente prejudicando, ao mesmo tempo, a absorção e proteção imune do sistema⁴.

Os glicosaminoglicanos (carboidratos) das membranas são em sua maioria glicoproteínas ou glicolipídios de elevada complexidade e variabilidade estrutural, funcionando como sinalizadores das alterações sofridas pelas células⁵. Somando–se a isso, lectinas apresentam alta especificidade por carboidratos e são utilizadas para detectar alterações celulares estruturais e bioquímicas em diferentes situações de injúrias⁶.

Diferentes modelos experimentais de interações entre lectinas e células do trato gastrointestinal têm sido empregados, tais como: a modulação e controle de infecções do ambiente gastrointestinal de ratos infectados por Salmonella⁷, aderência e reconhecimento da Giárdia lamblia pelas células intestinais em humanos⁸, estudos das alterações nos receptores de superfície das células epiteliais durante a infecção por bactérias intestinais em ratos⁹. Devido à sua versatilidade, as lectinas são também utilizadas como vetores biológicos (bioadesinas) carreando vacinas para as mucosas intestinal e respiratória¹⁰.

Uma das mais freqüentes aplicações das lectinas é como marcador histoquímico de tecidos que sofreram transformações neoplásicas⁶, na identificação de tipos celulares específicos como macrófagos/histiócitos¹¹ , células M intestinais¹² e outras células das mucosas gástrica e intestinal em diversos modelos experimentais¹³.

OBJETIVO

Avaliar através da histoquímica com lectinas a expressão de glicosaminoglicanos (mucinas) nas células do trato gastrointestinal de ratos expostos ao etanol.

MÉTODO

Animais em dieta

Vinte e oito (28) ratos machos Wistar recém–desmamados (25dias) foram expostos, diariamente, ao etanol (3g/kg de peso através da cânula orogástrica, por períodos de 15 (G15, n=7), 30 (G30, n=7) e 45 (G45, n=7), e comparados a um grupo controle (35 dias). Todos os grupos receberam dieta comercial (LABINA– Purinaâ). O protocolo experimental desenvolvido foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética em experimentação animal (CCB–UFPE – ofício 119/2003).

Amostra de tecidos

Os animais foram anestesiados, intraperitonialmente, com uma solução contendo 0,5% de cloralose e 12% de uretana, em dose de 1,0ml/kg de peso. Após abertura do tórax e introdução de uma cânula de polietileno no ventrículo esquerdo, foram injetados 200ml de formalina 10% tamponada. Em seguida, procederam-se a retirada do intestino delgado e estômago, que foram preservados em solução de formalina até o momento da microtomia. Para os cortes histológicos, selecionaram–se fragmentos de regiões distintas do intestino (jejuno e íleo) e estômago (corpo e antro), submetidos a rotina histológica e incluídos em parafina. Os cortes histológicos (4mm) foram obtidos em micrótomo horizontal Yamato (Japan).

Histoquímica com Lectinas

Os fragmentos teciduais montados em lâminas histológicas albuminizadas foram tratados com solução de tripsina (0,1%) a 37^oC por 2 minutos, expostos ao H₂O₂ por 20 minutos e incubados a 4^o C por 2 horas com lectinas (PNA–25 mg/ml, WGA–25 mg/ml e Con A–50 mg/ml) conjugadas à peroxidase (Sigma). Posteriormente as lâminas foram mergulhadas por 10 minutos em 10 mM de tampão fosfato (PBS) pH 7.2. A reação da peroxidase foi visualizada após incubação por 5 a 8 min em PBS contendo diaminobenzidina (DAB) e peróxido de hidrogênio. As lâminas foram contracoradas com hematoxilina e analisadas em microscópio óptico (Olympus BH–2, Japão). Para controle, as lectinas foram inibidas utilizando–se methyl–a–D–manose para Con A, Dgalactose para PNA e N–acetilglicosamina para WGA (Sigma).

Para o estudo do padrão de marcação das lectinas aplicou–se uma escala semiquantitativa (DxI) calculada levando–se em consideração a intensidade da coloração (I), variando de 1 a 4, e a distribuição (D) variando entre fraca (+), moderada (++) e intensa (+++), conforme metodologia utilizada. ¹⁶.

Histoquímica das mucinas

As imagens das lâminas histológicas foram capturadas utilizando um sistema de análise de imagens Optimas^TM 6.1 (Optimas Corporation, USA), conectado a um microscópio óptico padrão. Os padrões de marcação dos glicosaminoglicanos foram calculados pelo número médio de células marcadas (área total 12234 µm²), em 5 campos aleatórios por lâmina de cada animal. Os resultados obtidos foram submetidos ao estudo estatístico utilizando–se os Testes t de student e de Tukey, com p<0,05, através do software PRISMA 3.0^â.

RESULTADOS

Histomorfologia

A histologia da mucosa gastrointestinal nos grupos estudados não mostrou alterações importantes entre os períodos de exposição ao álcool. A mucosa do estômago, na região do corpo apresentou discreta atrofia das glândulas no grupo G45, principalmente na região glandular apical, enquanto as células e a organização das criptas não diferiu, morfologicamente, entre os indivíduos. A membrana da mucosa do estômago, mais precisamente da camada epitelial, exibiu células descamadas, além de uma camada regular de muco recobrindo o epitélio, que aumentou progressivamente nos grupos G30 e G45.

A mucosa do intestino delgado mostrou–se formadas por diversos tipos celulares, com destaque para células absortivas e caliciformes. Apesar da exposição ao etanol, a mucosa não apresentou alterações morfológicas importantes, apenas uma ligeira diminuição do numero e altura das vilosidades e glândulas de Lieberkühn.

Histoquímica das mucinas

Quanto às reservas de glicosaminoglicanos pelas células da mucosa intestinal reveladas pela reação com PAS e Alcian blue, observou–se um gradativo aumento da expressão dos mesmos pelas células produtoras de muco à medida que o período de exposição ao etanol aumentou (Tabela 1).

Foi confirmado o aumento na produção de mucopolissacarídeos neutros, evidenciado pela intensa marcação de PAS nas regiões foveolar e apical das células de reserva no corpo gástrico, à medida que a exposição ao etanol foi intensificada, principalmente aos 45 dias.

Na região antral não houve marcação para presença de mucinas ácidas ou neutras para nenhum dos períodos de exposição. No intestino delgado a analise qualitativa não evidenciou diferença na expressão de mucina neutra nem no número de células PAS–positivas nos diferentes períodos de exposição ao etanol.

Histoquímica com Lectinas

As lectinas utilizadas mostram padrões de ligação crescentes com o aumento dos períodos de expçosição ao etanol (Tabela 2).

A PNA foi a mais seletiva das lectinas testadas, marcando, exclusivamente, células do colo e ístmo das glândulas gástricas e com reação negativa para o muco, apresentando um padrão granular de marcação para os eritrócitos. A Con A revelou u'a marcação mais intensa nas regiões do ístmo e criptas das glândulas fúndicas estomacais e falha na marcação do muco, mostrando o mesmo padrão de marcação obtido pela PNA em relação aos eritrócitos. Quanto à WGA, esta marcou, especificamente, as células caliciformes, bem como o muco e os grânulos das células de Paneth, contidas nas glândulas de Liberkühn no intestino. Na mucosa do estômago, revelou um padrão de marcação bastante difuso e inespecífico.

DISCUSSÃO

O etanol sendo uma molécula polar, pode interagir com uma região hidrofóbica de macromoléculas, ligando–se a uma variedade de proteínas e carboidratos de membranas¹⁷. Um dos efeitos tóxicos do etanol se reflete na função básica do epitélio intestinal e quando ocorre lesão, os processos de absorção são prejudicados, desencadeando "síndrome de má absorção"⁴. Atualmente se sabe que tanto o etanol, quanto o seu principal metabólito, o acetaldeído, são indicados como responsáveis por diversos distúrbios da mucosa intestinal, além de serem fatores carcinogênicos tanto para os ratos,¹⁸ como para seres humanos¹⁹.

O aumento da síntese e distribuição de mucina ácida e neutra pelas células mucosas do estômago e intestino, observado neste estudo, pode ser explicada pela ação tóxica do etanol que, ao ser ingerido oralmente, é transportado ao intestino, onde uma parte é oxidada pelas bactérias residentes na mucosa, que produzem boa parte do acetaldeído tóxico aos eritrócitos, alterando a produção e secreção de muco²⁰.

No epitélio gastrintestinal a mucosa é coberta por um mucoprotetor, composto principalmente de glicoproteínas–mucinas, sintetizado pelas células superficiais (goblet cells), células estas sensíveis às agressões sofridas pela mucosa²¹.

A observação de achados idênticos quanto às regiões positivas para Alcian blue/PAS e a marcação da lectina WGA para o muco, reafirma a possibilidade da utilização de lectinas como biomarcadores, se tornando uma das ferramentas para o estudo da mucosa gastrintestinal, devido a sua afinidade por substâncias do muco²².

Os glicoconjugados do muco são, possivelmente, relacionados a muitas doenças, apresentando diferenças na sua composição entre a mucosa gástrica normal e durante as situações de estresse como, por exemplo, a ingestão de álcool²³.

As lectinas utilizadas mostram variados padrões de marcação para a mucina produzida pelas células secretoras, evidenciando a presença de tipos específicos de carboidratos, mais especificamente, nacetilglicosamina, como um componente importante da proteção da mucosa gastrintestinal.

As afinidades das lectinas Con A, PNA e WGA pelas células da mucosa gástrica observadas, demonstradas pela marcação intensa e específica a determinados grupos celulares, são corroborada por outros autores, que em estudos recentes^26,27 observaram marcação pela PNA na superfície foveolar e células epiteliais, enquanto com WGA essas regiões mostraram–se negativas²⁷. Outros trabalhos afirmam, ainda, que várias lectinas ligam–se, especificamente, a mucinas estomacais e células gástricas, como as lectinas Meã I–II²⁸, BPA e VVA²⁹.

Em relação às variações de intensidade observadas nos padrões de ligação das lectinas, esses resultados são semelhantes a estudos anteriores que atribuíram esse fato aos efeitos tóxicos da exposição ao etanol sobre a extensão da ligação e distribuição de lectinas nos tecidos³⁰.

A ausência de alterações estruturais mais evidentes no epitélio gastrointestinal dos ratos nesse estudo, deve–se à alta capacidade de regeneração desse epitélio que é corroborado por estudo ultraestrutural da mucosa gástrica durante a exposição ao etanol³¹. A ingestão crônica do álcool favorece uma resposta adaptativa das membranas, apesar desta interação álcool–membrana ocasionar mudanças significativas no funcionamento das mesmas³².

Desta, os resultados obtidos sugerem um importante papel das glicoproteínas durante alterações e reorganização do ambiente celular gastrointestinal quando exposto às situações de estresse. Podendo–se, assim, em concordância com especulações anteriores³³, confirmar os efeitos do álcool no glicocálice e instituir a histoquímica com lectinas como uma possível ferramenta para detectar os graus de toxicidade alcoólica nas células.

CONCLUSÕES

Os resultados comprovaram a existência de uma intima relação entre a ingestão crônica de etanol, subseqüente síntese/expressão de mucinas pelas células mucosas e os padrões diferenciados de marcação de lectinas, indicando também alterações na expressão de carboidratos pelas células do trato grastrointestinal, quando expostas a toxinas como o etanol.

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Endereço para correspondência
Prof. Mario Ribeiro de Melo–Junior
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami, LIKA,
Universidade Federal de Pernambuco, UFPE.
Av. Morais Rêgo s/n, Campus Universitário – CEP 50670–910. ]]> E–mail: mariormj@gmail.com

Recebido em 18.08.2006
Aprovado em 05.10.2006

¹Trabalho desenvolvido no Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami – LIKA/UFPE