Potencial anti-Leishmania e imunomodulador dos extratos de Campsiandra laurifolia Benth. (Fabaceae)

Anti-Leishmania and immunomodulatory potential of extracts of Campsiandra laurifolia Benth. (Fabaceae)

Potencial anti-Leishmania y inmunomodulador de extracto de Campsiandra laurifolia Benth. (Fabaceae)

Anadeiva Portela Chagas^I; Adolfo Henrique Müller^II; Milene Soares^III; Lourdes Maria Garcez^IV

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RESUMO

Palavras-chave: Fitoterapia; Extratos Vegetais; Fabaceae; Leishmaniose; Imunossupressão.

ABSTRACT

Infusions of leaves, bark and seeds of Campsiandra laurifolia Benth. (Fabaceae) are used by communities of African-American descendants of slaves (quilombolas) mainly for treatment of cutaneous Leishmaniasis (CL), wounds, ulcers and tinea. Hydroalcoholic and aqueous extracts of C. laurifolia were investigated for anti-Leishmania activity on promastigotes and amastigotes of Leishmania (L.) amazonensis and immunomodulatory responses, including cell proliferation of splenocytes and NO production by peritoneal macrophages from BALB/c mice. The hydroalcoholic extracts of the bark and the aqueous extracts of the leaves and seeds presented a reduced activity against amastigotes and promastigotes (<20%), and the same result was observed for the inhibition of NO production by activated macrophages (<23%). Most of the extracts displayed a moderate immunosuppressive potential (32.6 to 38.5%); on the other hand, the aqueous extracts of seeds inhibited up to 87% of the growth of splenocytes of BALB/c mice stimulated with mitogens. Such activity may explain the use of C. laurifolia for the treatment of CL by quilombolas. Its use may not be mainly associated with a direct action on the parasite but with an anti-inflammatory activity because such activity decreases the tissue damage caused by the immune system in response to the infection and, consequently, aids the healing process of Leishmanial lesions.

Keywords: Phytotherapy; Plant Extracts; Fabaceae; Leishmaniasis; Immunosuppression.

RESUMEN

Las infusiones de las hojas, cortezas y semillas de Campsiandra laurifolia Benth. (Fabaceae) son utilizadas por las comunidades de descendientes de esclavos negros (denominados quilombos) para el tratamiento, principalmente, de la Leishmaniasis cutánea (LC), de heridas en la piel, de úlceras e impétigo. Se investigó con extractos hidroalcohólicos y acuosos de C. laurifolia la actividad anti-Leishmania en promastigotes de Leishmania (L.) amazonensis y la respuesta inmunomoduladora: proliferación celular de esplenocitos y producción de ON por macrófagos peritoneales de ratones BALB/c. Los extractos hidroalcohólicos de la corteza y acuosos de la hoja y de la semilla presentaron una menor actividad frente a las formas de amastigotes y promastigotes (<20%) y el mismo se observó para la inhibición de la producción de ON por los macrófagos activados (<23%). La mayoría de los extractos presentaron un moderado potencial inmunosupresor (de 32,6% a 38,5%), pero los extractos acuosos de la semilla (AS) inhiben hasta un 87% el crecimiento de esplenocitos BALB/c estimulados con mitógenos. Esa actividad puede explicar la indicación de los descendientes de quilombos (quilombolas) del uso de C. laurifolia para el tratamiento de LC, ya que su uso puede no estar asociado principalmente con una acción directa sobre el parásito, sino con una actividad inflamatoria, pues esa actividad disminuye el daño tisular causado por el sistema inmunológico en respuesta a la infección y, en consecuencia, ayuda en la cicratización de las lesiones ocasionadas por la Leishmaniasis.

INTRODUÇÃO

Várias classes de substâncias já foram isoladas, tais como alcalóides, lignanas, neolignanas, terpenos e ácido benzóico, e têm-se mostrado bioativas⁶. Porém, dentre 97 substâncias levantadas no trabalho de Chan-Bacab e Peña-Rodriguez⁴, apenas 2-n-propylquinoline, alcalóide das folhas de Galipea longiflora (Rutaceae), está em fase clínica para o tratamento da LC^9,10, pois a maioria das substâncias ensaiadas, in vivo, apresenta altos níveis de citotoxicidade e baixa atividade quando administradas em doses  moderadas^4,2. Contudo, tais esforços devem ser contínuos, pois a grande variabilidade de linhagens de Leishmania e o aparecimento de formas resistentes conduzem à necessidade de desenvolvimento de diferentes tipos de drogas¹⁰.

A espécie Campsiandra laurifolia Benth., uma leguminosa da família Fabaceae, é encontrada, no Brasil, principalmente nos Estados do Pará, Amapá e Amazonas, em áreas de igapó e às margens de igarapés e rios. A Manaiara, como é conhecida popularmente, é utilizada principalmente para o tratamento de feridas, impigem, malária, úlcera²³. A comunidade de Arancuã, um dos 27 remanescentes quilombos (descendentes de negros que resistiram à escravidão) dessa região, que fica às margens do rio Trombetas, próximo ao Município de Oriximiná, no Oeste do Estado do Pará, frequentemente se expõem ao vetor da LC, durante três meses do ano (janeiro a março). Nessa época, seus integrantes residem em áreas de floresta, para realizarem a coleta anual da castanha-do-Pará¹. Essa comunidade utiliza a infusão das folhas e a tapioca do fruto (parte amilácea obtida a partir da maceração aquosa e secagem em exposição à luz solar) para o tratamento da leishmaniose cutânea³. O uso popular, o grande número de indicações e a ausência de estudos químicos e biológicos da C. laurifolia sustentaram um screening preliminar dessa espécie. Portanto, o principal objetivo deste trabalho foi verificar o potencial anti-Leishmania e imunomodulador dos extratos obtidos de C. laurifolia de acordo com o conhecimento tradicional de comunidades quilombolas e realização de um estudo químico preliminar dos extratos que apresentaram atividades biológicas.

MATERIAIS E MÉTODOS

COLETA DO MATERIAL BOTÂNICO

Foram coletadas folhas, cascas do caule e sementes de C. laurifolia no período de setembro de 2002, na comunidade de Arancuã (596083,59 E; 9833128,18 N - UTM), um dos 27 remanescentes de quilombos, situada às margens do rio Trombetas, no Município de Oriximiná no Oeste do Estado do Pará, Brasil. A espécie vegetal foi selecionada a partir de um levantamento etnobotânico realizado em maio de 2002³, que teve como principal objeto identificar as espécies vegetais mais utilizadas pela comunidade para o tratamento de LC. A identificação da espécie foi realizada pela botânica Elisabeth van den Berg, herbário do Museu Paraense Emílio Goeldi, Belém, Pará.

CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

As atividades de coleta foram iniciadas após a obtenção da anuência prévia da comunidade que se deu pela assinatura de um termo de consentimento livre esclarecido (TCLE) pelos principais representantes da comunidade.

PRODUÇÃO DOS EXTRATOS

ANIMAIS

Foram utilizados camundongos BALB/c, fêmeas, com idade entre 2 e 3 meses (n = 1/ensaio), todos oriundos do biotério do Instituto Evandro Chagas, Belém, Pará. Os animais sofreram eutanásia em câmara de CO₂ e éter.

CULTIVO DOS PARASITOS

Promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) foram cultivadas a 27^o C em meio completo, i.e. RPMI 1640 (Sigma, EUA), contendo 10% de soro bovino fetal inativado (SBF) (Gibco, EUA); L-glutamina, 2 mM (Sigma, EUA); piruvato de sódio, 1,25 mM (Merk, Alemanha); penicilina, 100 UI/mL; estreptomicina, 100 µg/mL (Sigma, EUA) e 2-mercaptoetanol, 50 µM (Gibco, EUA).

OBTENÇÃO DE CÉLULAS ESPLÊNICAS E DE MACRÓFAGOS PERITONIAIS

Camundongos foram eutanizados com CO₂ ou éter, e em ambiente asséptico, ocorreu a retirada do baço ou de células residentes da cavidade peritonial. Para obtenção de esplenócitos, o baço foi macerado em meio RPMI-1640, e em seguida, o sobrenadante desta suspensão, foi lavado duas vezes em meio RPMI-1640 (10'/ 1500 rpm/10^o C). Os macrófagos residentes foram coletados da cavidade peritonial em meio Hank's (Sigma, EUA) e lavados em meio RPMI-1640 por duas vezes (10'/ 1500 rpm/10^o C). O número de células esplênicas e macrófagos após a lavagem, foi determinado com auxílio de um microscópio ótico e ajustadas de acordo com teste em meio RPMI-1640 contendo 10% de soro bovino fetal, penicilina 100 UI/mL e estreptomicina 100 µg/mL (meio completo).

AVALIAÇÃO DA CITOXICIDADE DOS EXTRATOS VEGETAIS

Células esplênicas (6 x 10⁶ células/poço) foram distribuídas em placas de cultura de 96 cavidades (Costar) e incubadas (37^o C/ 24 h, 5% CO₂ e 95% ar) em presença dos extratos vegetais (1 e 0,1 mg/mL) e ³H-timidina (1 µC/poço) (Amersham Life Science, Inglaterra). Controles consistindo somente de (i) suspensão de células e meio de cultura (controle negativo) e (ii) suspensão de células e saponina (Sigma, EUA) (1 mg/mL) (controle positivo) foram utilizados. Após incubação, as células foram coletadas em membranas de fibra de vidro para contagem de radioatividade incorporada em um contador ß (Cilintilador, Tri-cab-2100TR, Packard). A porcentagem de células viáveis foi determinada pelo índice de citotoxicidade (IC), dado pela quantidade de ³H-timidina incorporada pelas células tratadas com extratos em relação às células do controle negativo do ensaio.

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-PROMASTIGOTA

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-AMASTIGOTA

Células peritoniais (1 x 10⁵ macrófago/poço) foram adicionadas em tubos Eppendorfs e incubadas em atmosfera úmida (37^o C/3 h, 5% CO₂ e 95% ar) juntamente com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis (5 x 10⁵ parasitos/poço) em uma proporção de 5:1 (macrófago/promastigota). Após a infecção dos macrófagos, estes foram incubados (37^o C/24 h, 5% CO₂ e 95% ar) em presença dos extratos vegetais (1 mg/mL). Após incubação, um volume de 100 µL foi retirado da cultura e adicionado em lâminas para centrifugação em Citospin (Fanem, São Paulo) por 5 min a 500 rpm. Essas lâminas foram, então, fixadas com metanol absoluto (Cromato Produtos Químicos Ltda.) para coloração com corante Giemsa e posterior análise microscópica. O número de amastigota intracelular foi determinado pela contagem de amastigotas em 100 macrófagos infectados por amostra e os resultados foram expressos como porcentagem de inibição em relação ao controle negativo, poço contendo apenas células e meio RPMI^7,24.

AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR

Células esplênicas (4 x 10⁶ células/poço) foram distribuídas em placa de 96 cavidades e incubadas (37^o C/36 h, 5% CO₂ e 95% ar) com concanavalina A (1 µg/mL) e extratos de C. laurifolia (0,1 mg/mL). Após incubação foram adicionados 10 µL de ³H-timidina (1 µCi), sucedendo nova incubação (37^o C/12 h, 5% CO₂ e 95% ar). As células foram então coletadas em membranas de fibra de vidro e submetidas à leitura em um contador de radiação ß¹⁵. O percentual de inibição da linfoproliferação foi dado por um índice da inibição da incorporação de ³H-timidina em culturas de células estimuladas com ConA na presença dos extratos, com as células cultivadas apenas em presença dos extratos.

AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO

Macrófagos peritoniais (1 x 10⁶ células/poço) foram distribuídos em placa de cultura de 96 cavidades para posterior incubação em atmosfera úmida (37^o C/2 h, 5% CO₂ e 95% ar). Após a remoção das células não aderidas, foram adicionados à cultura LPS (Sigma, EUA) (Lipopolysaccharides Escherichia coli 0111:B4) (500 ng/mL), (5 ng/mL) e extratos de C. laurifolia (0,1 mg/mL). O controle negativo consistiu de células aderidas, RPMI completo, LPS (500 ng/mL) e (5 ng/mL), e o positivo apenas de células aderidas e RPMI completo. Sucedeu-se a incubação (37^o C/24 h, 5% CO₂ e 95% ar). Em seguida, os sobrenadantes das culturas foram aspirados e a dosagem de ON produzido, foi feita de acordo com o método de Griess⁵. O percentual de inibição foi dado por um índice de inibição da produção de óxido nítrico das células tratadas com extrato, em comparação à produção de óxido nítrico das células não tratadas com extrato.

ESPECTRO DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR / SCREENING FITOQUÍMICO

Os espectros de RMN ¹H a 300 MHz foram registrados em espectrômetro modelo Mercury 300/Varian (DQ-UFPA), e a 500 MHz em espectrômetro modelo DRX500/Bruker (CENAUREN-DQ-UFC). Para a realização da análise fitoquímica foi preparada uma solução padrão com o extrato liofilizado das sementes. Cerca de 5 g do extrato foram transferidos para um Becker e dissolvidos em 30 mL de álcool a 80%. A solução obtida foi levada ao banho-maria por 30 min e filtrada sob pressão. Com a solução resultante foram feitos testes químicos para verificar a presença das seguintes classes de metabólitos secundários: alcalóides, flavonóides, taninos, saponinas, esteróides, triterpenóides, antraquinona.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

RESULTADOS

Nos ensaios biológicos, nenhum dos extratos de C. laurifolia foi citotóxico na concentração 0,1 mg/mL, variando entre 0,6% (HC) a 14,4% (AQF), e inferiores ao índice considerado positivo para citotoxicidade (30%), bem como ao controle saponina (p<0,01) (dados não apresentados). Apesar desta concentração ter sido padronizada para quase todos os ensaios, a concentração 1 mg/mL foi posteriormente avaliada, e utilizada para investigar atividade antiamastigota intracelulares. Porém, mesmo nesta concentração dez vezes maior em relação à primeira os índices de citotoxicidade variaram entre 0% (AQF, AFF) e 3,8% (HC), o que sugere a ausência de atividade tóxica sobre macrófagos, mesmo quando usadas altas concentrações dos extratos. Todos os extratos revelaram, também, baixos índices de citotóxicos, tanto para as formas promastigotas (<3.3%) (Figura 1) quanto para as amastigotas intracelulares de L. (L.) amazonensis (<20%) (Figura 2). Baixos índices também foram observados para a inibição da produção de ON em macrófagos ativados, pois os percentuais variaram de 14% (extrato aquoso da semente produzido no laboratório) a 23% (extrato hidroalcoólico da casca), diferindo significativamente do controle negativo, células que não receberam tratamento (Figura 3). No entanto, esses extratos inibiram significativamente a proliferação de células esplênicas isoladas de camundongos BALB/c cultivadas com concanavalina A. Este efeito inibitório da linfoproliferação foi mais evidente no extrato ASC, chegando a 86% (Figura 4A), e observado em menor escala nos demais extratos (33,8 a 38,5%) quando avaliados na concentração de 0,1 mg/mL. Já o extrato ASL apresentou índices de inibição semelhantes ao ASC apenas quando testado em uma concentração dez vezes maior (1 mg/mL) (Figura 4B).

Figura 1 - Efeito leishmanicida dos extratos de Campsiandra laurifolia Benth. Promastigotas de Leishmania (Leishimania) amazonensis cultivados na presença dos extratos da planta (0,1 mg/mL): aquoso a frio da folha (AFF), aquoso a quente da folha (AQF), hidroalcóolico da casca (HC), aquoso da semente produzido pela comunidade (ASC) e aquoso da semente produzido no laboratório (ASL). Como controles negativo e positivo, respectivamente, meio de cultura (CN) e anfotericina B a 0,025 mg/mL (CP). O índice de inibição de promastigotas expressa, em porcentagem, a razão entre promastigotas viáveis^* tratadas e não tratadas com extrato teste. Diferença entre o controle positivo e os demais tratamentos (p<0,001)

Figura 2 - Efeito leishmanicida dos extratos de Campsiandra laurifolia Benth. sobre formas amastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis. Macrófagos peritoneais (MØ) de camundongos BALB/c infectados com promastigotas de L. (L.) amazonensis  e cultivados na presença dos extratos da planta (1 mg/mL): aquoso a frio da folha (AFF), aquoso a quente da folha (AQF), hidroalcóolico da casca (HC), aquoso da semente produzido pela comunidade (ASC) e aquoso da semente produzido no laboratório (ASL). Como controles negativo e positivo, respectivamente, meio de cultura (CN) e anfotericina B a 0,025 mg/mL (CP). O índice de inibição de amastigotas expressa, em porcentagem, a razão entre o número de amastigotas^† infectando macrófagos tratados e não tratados com extrato teste. Houve diferença entre o controle positivo e os demais tratamentos (p<0,05)

Figura 3 - Efeito dos extratos de Campsiandra laurifolia Benth. sobre a produção de óxido nítrico em macrófagos ativados. Macrófagos peritoniais (MØ) de camundongos BALB/c cultivados empresença de LPS (500 ng/mL) e (5 ng/mL) e dos extratos da planta: A - aquoso a frio da folha (AFF), aquoso a quente da folha (AQF), hidroalcóolico da casca (HC) e aquoso da semente produzido pela comunidade (ASC) na concentração de 0,1mg/mL e B - aquoso da semente produzido no laboratório (ASL) nas concentrações de 0,01; 0,1; 1 mg/mL. Como controles negativo e positivo, respectivamente, meio de cultura com LPS e (CN) e meio de cultura (CP). O índice de inibição da produção de óxido nítrico expressa, em porcentagem, a razão entre níveis de ON^‡ produzido pelas células tratadas e não tratadas com o extrato teste. Diferença entre o controle positivo e os demais tratamentos (p<0,001)

No sentido de verificar se havia diferenças químicas entre os extratos ASC e ASL, que justificassem atividades biológicas diferenciadas, cromatogramas e espectro de RMN ¹H foram observados. Nesta análise química preliminar foi constatado que tanto as diferenças físicas entre o extrato ASC (marrom e granuloso) e o ASL (branco e com aspecto de um pó fino) quanto as suas atividades biológicas, podem ter decorrido do desaparecimento de substâncias polares, de acordo com o cromatograma e espectro de RMN ¹H do extrato ASC (dados não apresentados), ocorrido durante a eliminação do solvente.

DISCUSSÃO

Em um levantamento etnobotânico, realizado na comunidade de Arancuã, Belém e Menezes³ identificaram 12 espécies vegetais utilizadas pela comunidade para o tratamento de LC, sendo que C. laurifolia foi a que recebeu maior número de indicações. Associando a essa indicação popular e à carência de estudos químicos e biológicos, C. laurifolia foi selecionada neste trabalho para avaliação da atividade anti-Leishmania e imunomodulação e análise química preliminar dos extratos bioativos. Extratos de diversas partes da planta foram obtidos no laboratório, e utilizou-se, também, um extrato aquoso da semente produzido por um curandeiro da comunidade (ASC).

Com relação à atividade anti-Leishmania, todos os extratos testados apresentaram baixos índices de citoxicidade, tanto para as formas promastigotas quanto para amastigotas de L. (L.) amazonensis. Baixos índices de inibição de ON também foram observados em todos os extratos, porém, o extrato das sementes se revelou potente imunossupressor sendo o ASC em maior potencial (0,1 mg/mL) (Figura 4A  e 4B).

Para avaliar as diferenças biológicas entre os dois modos de preparo (ASL e ASC), o pó (usado de forma tópica), resultante da extração aquosa das sementes - remédio mais utilizado pelos quilombolas para o tratamento das lesões de LC - foi submetido a um estudo fitoquímico preliminar. Porém, chamou atenção o fato desses dois extratos apresentarem diferenças físicas bem evidentes, isto é, cores e granulosidade diferentes, sugerindo uma provável distinção química entre eles. Especulou-se que tais transformações seriam consequência, principalmente, de reações fotoquímicas ocorridas com extrato ASC (exposição ao sol) durante a eliminação do solvente, pois observando o espectro de RMN ¹H algumas substâncias polares presentes neste extrato não foram evidenciadas no ASL (dados não apresentados). A produção em menor quantidade de tais substâncias polares pode ter reduzido significativamente o potencial imunossupressor do ASL em comparação ao ASC (0,1 mg/mL).

Em geral, a mensuração da imunossupressão baseia-se na detecção do crescimento celular resultante de uma ativação ou de condições da cultura, sendo que a inibição pode ocorrer quando as células têm seus fatores de crescimento suprimidos, ou quando há indução de energia ou apoptose celulares¹⁵. Como os extratos de C. laurifolia apresentam baixa citotoxicidade é provável que sua ação seja sobre os mediadores deste crescimento, e não pela indução de morte celular, como foi o caso de frações alcalóides de Boerhavia diffusa L., Nitaginaceae¹⁷. Além disso, o percentual de inibição da linfoproliferação do extrato aquoso da semente (86%) não foi estatisticamente diferente do valor encontrado nas células cultivadas na ausência de estímulo mitogênico (98%), o controle positivo.

Esta atividade de inibição da linfoproliferação foi observada também em extrato aquoso de Osbeckia aspera L. (Melastomaceae), planta usada tradicionalmente por indígenas para o tratamento de doenças do fígado. Ele confere proteção contra hepatotoxicidade, pois provavelmente a inibição do número de células leve a uma diminuição dos níveis de inflamação¹⁸. Esta correlação foi feita também por Punzon¹⁹ que utilizou extratos hidrometanólicos de Phlebodium decumanum Willd. (Polypodiaceae), demonstrando que a inibição do crescimento celular foi acompanhada pela diminuição dos níveis de IL-1 e TNF.  A redução da atividade biológica dessas citocinas pode levar à diminuição dos fatores que controlam genes proinflamatórios e de óxido nítrico sintetase induzível (iONS), sendo considerados interessantes como agentes anti-inflamatórios, principalmente para o tratamento de artrite reumatóide. Outras espécies, como Embrica officinalis (Euphorbiaceae) e Evolvulus alsinoides L. (Leguminoseae), apresentam atividades imunossupressoras associadas à diminuição das agressões foliculares de linfócitos em inflamações induzidas por adjuvantes de artrite reumatóide em modelos murinos¹¹.

Pelo fato das lesões cutâneas causadas por Leishmania spp., nas fases iniciais da infecção, envolverem reações inflamatórias, com participação de linfócitos, plasma celular, macrófagos e, em muitos casos, reações granulomatosas^16,13, drogas com potencial anti-inflamatório podem ajudar na cicatrização das lesões. Tal fato corrobora com a indicação quilombola de C. laurifolia para o tratamento de LCA, pois o seu uso pode não estar associado majoritariamente com uma ação direta sobre o parasito, mas sim com uma atividade anti-inflamatória importante, que diminui os danos teciduais causados pelo sistema imune em resposta à infecção.

Esta ação anti-inflamatória, in vivo, talvez seja intensificada pelo fato dos extratos de C. laurifolia apresentarem um pequeno potencial de inibição da produção de ON em macrófagos ativados (Figura 3), pois altos níveis desse metabólito, que deveria ser tóxico apenas para microorganismos, parasitos ou células tumorais, podem também lesar células saudáveis vizinhas, sendo este mecanismo responsável pela maioria dos processos inflamatórios e autoimunes^11,8,14,25. Vale a pena ressaltar a importância da observação do modo de preparo do extrato vegetal, pois a atividade descrita por um grupo étnico pode estar associada ao modo particular de sua obtenção, como é o caso do extrato ASC que apresenta sua atividade potencializada atribuída, provavelmente, à maneira pela qual a comunidade faz a eliminação do solvente (exposição ao sol¹²) e o tipo de solvente (água do rio - rica em matéria orgânica e ácidos húmicos²⁴). Outros ensaios são requeridos, principalmente utilizando frações isoladas do extrato ASC e ASL no sentido de elucidar uma ou mais substâncias supostamente envolvidas na atividade imunossupressora desse vegetal.

CONCLUSÃO

Atividade anti-Leishmania não foi evidenciada em nenhum dos extratos de C. laurifolia. Porém, os extratos da semente, em maior evidência no extrato produzido pela comunidade (ASC), apresentam satisfatório potencial imunossupressor. No entanto, frações purificadas desses extratos devem ser avaliadas, principalmente polares, com o objetivo de verificar o potencial imunomodulador e anti-inflamatório dessa espécie.

AGRADECIMENTOS

A doutora Elisabeth van den Berg, botânica do Museu Paraense Emílio Goeldi, Belém, Pará, pela identificação taxonômica da espécie vegetal em estudo. Aos mestres José Fernando Oliveira e Matheus do Santos de Sá do Laboratório de Imunofarmacologia do Centro de Pesquisa Gonçalo Muniz/FIOCRUZ, Salvador, Bahia, pela colaboração na realização dos ensaios biológicos. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo auxílio financeiro e à Prefeitura Municipal de Oriximiná pelo apoio logístico nas viagens de campo. 

1 Acevedo R, Castro E. Negros do Trombetas: guardiães de matas e dos rios. 2. ed. Belém: CEJUP; 1998. 98 p.

2 Akendengue B, Ngou-Milana E, Laurens A, Hocquemiller R. Recent advances in the against Leishmaniasis with natural products. Parasite. 1999 Mar;6(1):3-8.         [ Links ]

3 Belém HRF, Menezes CCS. As terapias tradicionais dos quilombolas de Arancuã [monografia]. Belém: Centro Universitário do Pará, Departamento de Farmácia; 2003.

4 Chan-Bacab MJ, Peña-Rodríguez LM. Plant natural products with leishmanicidal activity. Nat Prod Rep. 2001 Dec;18(6):674-88.

5 Choi CY, Kim JY, Kim YS, Chung YC, Seo JK, Jeong HG. Aqueous extract isolated from Platycodon grandiflorum elicits the release of nitric oxide and tumor necrosis factor-a from murine macrophages. Int Immunopharmacol. 2001 Jun;1(6):1141-51. DOI:10.1016/S1567-5769(01)00047-9         [ Links ]

6 Damre AS, Gokhale AB, Phadke AS, Kulkarni KR, Saraf MN. Studies on the immunomodulatory activity o flavonoidal fraction of Tephrosia purpurea. Fitoterapia. 2003 Apr;74(3):257-61. DOI:10.1016/S0367-326X(03)00042-X         [ Links ]

7 Delorenzi CJ, Attias M, Gattass CR, Andrade M, Rezende  C,  Pinto  AC,  et al.  Antilieshmania activity of Indole alkaloide from Peschiera australis. Antimicrob Agents Chemother. 2001 May;45(5):1349-54. DOI:10.1128/AAC.45.5.1349-1354.2001         [ Links ]

8 Flora Filho R, Zilberstein B. Óxido nítrico: o simples mensageiro percorrendo a complexidade: metabolismo, síntese e função. Rev Assoc Med Bras. 2000;46(3):265-71. DOI:10.1590/S0104-42302000000300012         [ Links ]

9 Fournet A, Barrios AA, Munoz V, Hocquemiller R, Cave A. 2-Substituted quiloline alkaloids as potential antiLeishmanial drugs. Antimicrob Agents Chemother. 1993 Apr;37(4):859-63.         [ Links ]

10 Fournet A, Ferreira ME, Arias AR, Ortiz ST, Fuents S, Nakayama H, et al. In vivo efficacy of oral end intralesional administration of 2-substituted quinolines in experimental treatment of new world cutaneous Leishmaniasis caused by Leishmania amazonensis. Antimicrob Agents Chemother. 1996 Nov;40(11):2447-51.         [ Links ]

11 Ganju L, Karan D, Chanda S, Srivastava KK, Sawhney RC, Selvamurthy W. Immunomodulatory effects of agents of plant origin. Biomed Pharmacother. 2003 Sep;57(7):296-300. DOI:10.1016/S0753-3322(03)00095-7         [ Links ]

12 Goradio AC. Modelos clássicos de estudo quantitativo das relações entre estrutura química e atividade biológica. Quim Nova. 1996;9(3):278-89.         [ Links ]

13 Hepburn NC. Cutaneous Leishmaniasis. Clin Exp Dermatol. 2000 Jul;25(5):363-70. DOI:10.1046/j.1365-2230.2000.00664.x         [ Links ]

14 Ignácio SRN, Ferreira JLP, Almeida MB, Kubelka CF. Nitric oxide production by murine peritoneal macrophages in vitro and in vivo treated with Phyllanthus tenellus extracts. J Ethnopharmacol. 2001 Feb;74(2):181-7. DOI:10.1016/S0378-8741(00)00371-8         [ Links ]

15 Kaufmann SHE, Kabelitz D. Immunology of infection: methods in microbiology. New York:  Academic Press; 1998.

16 Machado P, Araújo C, Silva AT, Almeida RP, D'Oliveira A Jr, Bittencourt A, et al. Failure of early treatment of cutaneous Leishmaniasis in preventing the development of ulcer. Clin Infect Dis. 2002 Jun;34(12):69-73. DOI:10.1086/340526         [ Links ]

17 Mungantiwar AA, Nair AM, Shinde UA, Dikshit VJ, Saraf MN, Thakur VS, et al. Studies on the immunomodulatory effects of Boerhaavia diffusa alkaloidal fraction. J Ethnopharmacol. 1999 May;65(2):125-31. DOI:10.1016/S0378-8741(98)00153-6         [ Links ]

18 Nichol DS, Daniels HM, Thabrew MI, Grayer RJ, Simmonos MSJ, Hughes RD. In vitro studies on the immunomodulatory effects of extracts of Osbeckis aspera. J Ethnopharmacol. 2001 Nov;78(1):39-44.         [ Links ]

19 Punzon C, Alcaide A, Fresno M. In vitro anti-inflammatory activity of Phlebodium decumanum. Modulation of tumor necrosis factor and soluble TNF receptores. Int Immunopharmacol. 2003 Set;3(9):1293-9. DOI:10.1016/S1567-5769(03)00117-6         [ Links ]

20 Roberts LJ, Handman E, Foote SJ. Science, medicine, and the future: Leishmaniasis. BMJ. 2000 Sep;321(7264):801-4.         [ Links ]

21 Sampaio RNR, Takano GHS, Malacarne ACB, Pereira TR, Magalhães AV. Ineficácia in vivo da terbinafina em leishmaniose cutânea causada por Leishmania (Leishmania) amazonensis em camundongos C57BL6. Rev Soc Bras Med Trop. 2003 jul-ago;36(4):531-3. DOI:10.1590/S0037-86822003000400018         [ Links ]

22 Torres-Santos EC, Moreira DL, Kaplan MAC, Meireiles MN, Rossi-Bergmann B. Selective effect of 2'6'-dihydroxy-4'-methoxychalcone isolated from Piper aduncum on Leishmania amazonensis. Antimicrob Agents Chemother. 1999 May;43(5):1234-41.         [ Links ]

23 Tropical Plant Database. Campsiandra laurifolia [Internet]. Carson: Raintree Nutrition. 1996. [citado 2009 set 16]. Disponível em: http://www.rain-tree.com/Campsiandra.htm.         [ Links ]

24 Van Rensburg CE, Naude PJ. Potassium humate inhibits complement activation and the production of inflammatory cytokines in vitro. Inflammation. 2009 Aug;32(4):270-6. DOI:10.1007/s10753-009-9130-6         [ Links ]25 Zhao F, Nozawa H, Daikonnya A, Kondo K, Kitanaka S. Inhibitors of Nitric Production from Hops (Humulus lupulus L.). Biol Pharm Bull. 2003 Jan;26:61-5.         [ Links ]

Correspondência/Correspondence/Correspondencia:
Anadeiva Portela Chagas ]]> Instituto Evandro Chagas
Seção de Parasitologia, Laboratório de Imunologia e Epidemiologia
Rodovia BR316, km 7, s/n^o, Levilândia
CEP: 67030-000 Ananindeua-Pará-Brasil
E-mail: anadeivachagas@iec.pa.gov.br

Recebido em / Received / Recibido en: 31/7/2009
Aceito em / Accepted / Aceito en: 25/9/2009

^* Metabolização de MTT.

^‡ Método de Griess.

^§ Incorporação de ³H-timidina.