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Detecção de metapneumovírus humano em crianças portadoras de infecções respiratórias agudas atendidas em um hospital de urgência e emergência em Belém, Estado do Pará, Brasil^*

Detection of human metapneumovirus in children with acute respiratory infections treated at a hospital of emergency in Belém, Pará State, Brazil

Detección de metapneumovirus humano en niños portadores de infecciones respiratorias agudas atendidas en un hospital de urgencia y emergencia en Belém, Estado de Pará, Brasil

^IUniversidade do Estado do Pará, Belém, Pará, Brasil
^IIUniversidade do Estado de São Paulo, São Paulo, São Paulo, Brasil

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RESUMO

OBJETIVO: Realizar avaliação clínica e detecção de metapneumovírus humano (MPVh) de crianças abaixo de 5 anos de idade, portadoras de infecções respiratórias agudas (IRA), com livre procura ou referenciadas a um hospital de urgência e emergência em Belém, Estado do Pará, Brasil. ]]> MATERIAIS E MÉTODOS: Estudo longitudinal prospectivo (março de 2008 a fevereiro de 2009), avaliando 67 amostras de secreções nasofaríngeas de 67 pacientes com IRA - 29,9% com doença limitada ao sistema respiratório superior (DSRS) e 70,1% com doença do sistema respiratório inferior (DSRI) e DSRS - por meio de reação em cadeia mediada pela polimerase precedida de transcrição reversa em tempo real.
RESULTADOS: Na coorte de n = 67 crianças investigadas, foram detectados 13 casos (19,4%) positivos para MPVh. Houve maior porcentagem de identificação viral (61,5%) naqueles com DSRS associadas à DSRI, em relação aos com DSRS (38,5%).
CONCLUSÃO: Foi observado que o MPVh é um agente etiológico prevalente em 19,4% das crianças com IRA, no entanto, as manifestações clínicas avaliadas não ocorrem exclusivamente em associação com o MPVh.

Palavras-chave: Metapneumovirus; Infecções Respiratórias; Saúde da Criança.

ABSTRACT

OBJECTIVE: Performing clinical and human metapneumovirus detection (hMPV) of children under 5 years old suffering from acute respiratory infections (ARI), with free demand or referenced to an emergency care hospital in Belém, Pará State, Brazil.
MATERIALS AND METHODS: A prospective longitudinal study (from March 2008 to February 2009) evaluated 67 samples of nasopharyngeal secretions of 67 patients with ARI - 29.9% with upper respiratory tract infection (URTI) and 70.1% with lower respiratory tract infection (LRTI) and URTI - by using real time reverse transcription polymerase chain reaction assay.
RESULTS: In the cohort of n = 67 children studied, 13 positive cases were detected (19.4%) for hMPV. There was a higher percentage of samples (61.5%) in those with URTI associated with LRTI, compared to those with URTI (38.5%).
CONCLUSION: It was observed that hMPV is a prevalent etiological agent in 19.4% of children with ARI, however the clinical symptoms evaluated do not occur exclusively in association with hMPV.

Keywords: Metapneumovirus; Respiratory Tract Infections, Child Health.

OBJETIVO: Realizar evaluación clínica y detección de metapneumovirus humano (MPVh) de niños menores de 5 años de edad, portadores de infecciones respiratorias agudas (IRA), con demanda libre por atención o remitidos a un hospital de urgencia y emergencia en Belém, Estado de Pará, Brasil.
MATERIALES Y MÉTODOS: Estudio longitudinal prospectivo (marzo de 2008 a febrero de 2009), evaluando 67 muestras de secreciones nasofaríngeas de 67 pacientes con IRA - 29,9% con enfermedad limitada al sistema respiratorio superior (TRS) y 70,1% con enfermedad del sistema respiratorio inferior (TRI) y TRS - por medio de reacción en cadena mediada por la polimerasa precedida de transcripción reversa en tiempo real.
RESULTADOS: En la cohorte de n = 67 niños investigados, se detectaron 13 casos (19,4%) positivos para MPVh. Hubo un mayor porcentaje de identificación viral (61,5%) en los portadores de TRS asociados al TRI, en relación a los con TRS (38,5%).
CONCLUSIÓN: Se observa que el MPVh es un agente etiológico prevalente en 19,4% de los niños con IRA, sin embargo, las manifestaciones clínicas evaluadas no suceden exclusivamente en asociación al MPVh.

Palabras clave: Metapneumovirus; Infecciones del Sistema Respiratorio; Salud del Niño.

INTRODUÇÃO

As infecções respiratórias agudas (IRA) são as causas mais frequentes de doenças no mundo, com maior incidência em crianças com idade abaixo dos cinco anos¹. Desnutrição energético-proteica, prematuridade, baixo peso ao nascer, doenças com repercussão respiratória, inadequada condição socioeconômica e cultural da família, aleitamento materno, tabagismo e poluição ambiental são importantes fatores predisponentes e determinantes de IRA². O monitoramento dos micro-organismos envolvidos na IRA e a identificação desses agentes orientam as medidas terapêuticas e preventivas, evitando o uso desnecessário de antibióticos e auxiliando no controle de infecções hospitalares³.

O MPVh foi descrito pela primeira vez como agente etiológico de IRA em 2001 na Holanda. Suas características são semelhantes ao efeito citopático produzido pelo VSR, com formação de sincícios característicos seguido pelo rápido rompimento das células e subsequente destacamento da placa de cultura¹¹.

O MPVh apresenta relação genética com o pneumovírus aviário. Genoma constituído por oito genes que codificam nove proteínas, promovendo grande similaridade ao VSR. Pertence à ordem Mononegavirales, família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae e gênero Metapneumovirus¹².

A epidemiologia do MPVh é complexa e dinâmica, apresenta duas linhagens (A e B) e dois subgrupos de cada linhagem com diversidade antigênica. Cepas identificadas em uma região podem ser similares às cepas encontradas em outro local, em diferentes anos^13,14. A incidência mundial de MPVh varia de 1,5% a 41%^5,15. No Brasil, há poucos trabalhos realizados, com citações publicadas, referindo taxa de detecção de MPVh muito variável: em Fortaleza, Estado do Ceará, 8,69%¹⁶; em Curitiba, Estado do Paraná, 6,4%¹⁷; em Porto Alegre, Estado do Rio Grande do Sul, 14,5%¹⁸; Aracaju, Estado de Sergipe, 17%¹⁹; em Campinas, 5,6%²⁰, e em São Paulo, 4%²¹, Estado de São Paulo; e em Santa Maria, Estado do Rio Grande do Sul, 10,5%²².

O modo de transmissão do MPVh ocorre de maneira similar aos outros pneumovírus, pela inalação de secreções respiratórias contaminadas, objetos contaminados e manipulação^23,24,25.

No Brasil, casos de infecções por MPVh na Região Norte (Região Amazônica) e Nordeste foram detectados durante o período epidêmico do VSR, apresentando uma associação com o período chuvoso. Este achado difere do padrão observado na Região Sul do Brasil, onde o pico de atividade do MPVh está associado aos meses mais frios. Em países do hemisfério norte, o MPVh circula predominantemente nos meses de inverno e primavera. No hemisfério sul, há uma grande variação na sazonalidade do vírus^26,27. O MPVh acomete em pessoas de todas as faixas etárias, principalmente em menores de 5 anos. Crianças abaixo de 2 anos de idade, idosos, portadores de doenças pulmonares crônicas e imunocomprometidos representam o grupo de risco. Os acometimentos mais frequente são bronquiolite, pneumonia e bronquite^16,28.

Vários estudos têm demonstrado o diagnóstico molecular como o melhor método para detecção de vírus respiratórios. Pela dificuldade de cultivo celular em relação ao MPVh, a polimerase precedida de transcrição reversa em tempo real, torna-se a técnica mais adequada (padrão ouro) para detectar e quantificar o MPVh em espécimes respiratórios^5,29. O desenvolvimento de vacinas contra o MPVh encontra-se em fase experimental.

Desta forma, o objetivo deste estudo foi realizar a detecção de MPVh em crianças abaixo de 5 anos de idade, portadoras de IRA, com livre procura ou referenciadas a um hospital de urgência e emergência em Belém, Estado do Pará, Brasil, e com avaliação das manifestações clínicas apresentadas.

MÉTODOS

Os critérios de inclusão foram: Assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido; ter idade abaixo de 5 anos; sintomatologia clínica até sete dias de duração; quadro clínico de infecção respiratória aguda com caracterização de urgência e/ou emergência (mínimo de três manifestações clínicas: febre, dor, mal estar, tosse, cansaço, esforço respiratório, cianose, alterações radiológicas de tórax).

Com a identificação e os dados clínicos de cada criança incluídos no estudo, foi coletada secreção da nasofaríngea, sendo a criança acompanhada, pelo autor da pesquisa, até a completa resolução da doença, com o objetivo de determinar a evolução clínica de cada caso pesquisado. A coleta de secreção nasofaríngea foi realizada em cama de atendimento, na sala de exame médico. O paciente foi acompanhado por dois técnicos de enfermagem do próprio hospital no momento em que se realizava a coleta.

Quanto à condição nutricional, foi utilizado o critério de Gomez, o qual se baseia no índice de peso para a idade (P/I), do percentil 50 (p50). O paciente eutrófico apresenta P/I superior a 90% do p50 e o desnutrido de primeiro grau apresenta P/I entre 76% a 90% do p50³⁰.

Quanto às manifestações clínicas, foi considerada prostração quando a criança apresentava ao exame físico inicial: mal estar, fácies de sofrimento e irritabilidade.

O material utilizado na coleta consistiu de luvas, coletor plástico descartável de secreções (Marca Argyle DeLee Mucus Trap with Vacuum Breaker, número de catálogo 8884 - 7245 Sherwood) e bomba de aspiração (High Volume Vacuum Pressure Pump -número de catálogo xx 56.000.00).

Após a coleta, a secreção nasofaríngea acoplada ao coletor plástico foi identificada, mantida dentro da própria embalagem do coletor, devidamente fechada e acondicionada em caixa de isopor com gelo úmido e transportada ao Laboratório de Vírus Respiratórios do Instituto Evandro Chagas, em prazo não superior à 4 h. No laboratório, todo material era estocado em geladeira para processamento posterior.

EXTRAÇÃO DAS AMOSTRAS DOS TESTES

Foi utilizado o tubo eppendorf (2 mL), adicionado 560 μL de Buffer AVL/CarrierRNA e ainda 140 μL da amostra (retirados da alícota), agitado por 15 s (Vortex). O material foi incubado em temperatura ambiente por 10 min. Depois foi centrifugado brevemente para retirar bolhas da tampa, sendo adicionado 360 μL de etanol absoluto, agitado em Vortex por 15 s e novamente centrifugado brevemente. Foi aplicado, cuidadosamente, 630 μL da solução feita no eppendorf em um tubo de 2 mL com a placa de sílica, centrifugado a 8.000 rpm por 1 min à temperatura ambiente e transferido a coluna para outro tubo de 2 mL, descartando o anterior. O restante da solução do eppendorf de 630 μL foi aplicado na coluna encaixada no novo tubo, centrifugado a 8.000 rpm por 1 min à temperatura ambiente. A coluna foi novamente transferida para uma outra (tubo) de 2 mL, descartando o tubo anterior que continha o filtrado. Foi adicionado 500 μL de Buffer AW1, centrifugado a 8.000 rpm por 1 min à temperatura ambiente. A coluna foi transferida para outro tubo de 2 mL, descartando o anterior que continha o filtrado. Foi adicionado, ainda, 500 μL de Buffer AW2, transferindo a coluna para um novo tubo (2 mL), descartando o filtrado. Uma nova centrifugação foi realizada para retirar qualquer resquício de etanol, transferindo-se para outro tubo de 2 mL e acrescentando-se 60 μL de Buffer AVE. Por fim, o material foi incubado por 1 min à temperatura ambiente, centrifugado a 8.000 rpm por 1 min e estocado o RNA a -70° C.

TRANSCRIÇÃO REVERSA E REAÇÃO EM CADEIA MEDIADA PELA POLIMERASE EM TEMPO REAL (qRT-PCR)

Quanto à análise estatística, a prevalência pontual de MPVh foi calculada usando como denominador o total de pacientes da amostra. Também foi calculado o respectivo intervalo de confiança (IC95%). As comparações das frequências do MPVh, nas variáveis qualitativas, foram realizadas pelo teste do Qui-quadrado de independência, posteriormente foi aplicado o odds ratio para medir a força da associação entre os fatores de risco e a variável de desfecho (presença do MPVh), quando correu a restrição npq < 5 que foi a comparação das variáveis dicotômicas, sendo realizado o teste exato de Fisher. Para comparar as variáveis quantitativas, foi aplicado o teste t de Student e previamente fixado o nível α = 0,05 para rejeição da hipótese nula. No processamento estatístico, foram utilizados os programas BioEstat v.5.4 e o SPSS v.16.0.

RESULTADOS

Foram avaliadas 67 crianças no período de março de 2008 a fevereiro de 2009. A principal característica socioeconômica foi a baixa renda familiar (2 ± 1,5 salários mínimos) e insatisfatória condição de moradia (70,1%). A idade variou de 10 meses (mínimo) a 5 anos (máximo), com tendência central para 24 ± 14 meses. O tempo de acometimento da doença variou de dois a seis dias, com tendência central para três ± dois dias. A tabela 1 apresenta os dados clínicos e demográficos dessas crianças.

Das 67 crianças avaliadas, 13 delas (19,4%) apresentaram resultado positivo para MPVh. A tabela 2 mostra a proporção mensal e acumulada de casos positivos para MPVh. A figura 1 mostra resultados de MPVh positivos acumulados no período de março de 2008 a fevereiro de 2009. A partir da estatística descritiva, ficou notável que houve uma concentração de casos novos nos meses de março e abril de 2008. Para avaliar se nesse período houve maior incidência de MPVh, as proporções de casos positivos foram confrontadas com os dados do restante do período deste estudo (maio de 2008 a fevereiro de 2009). Para avaliar esta hipótese, foi aplicado o teste exato de Fisher com os seguintes dados: casos no bimestre (dez positivos em 26 crianças avaliadas) e casos no restante do período (três positivos em 41 crianças avaliadas). No período de março a abril de 2008, foi observado o maior crescimento de casos positivos para MPVh, nesse intervalo a proporção acumulada cresceu 35,1%, visto que em março era 18,2% e em abril passou para 53,3%.

A incidência de MPVh+ foi analisada comparativamente entre dois períodos de tempo: primeiro período, de março a abril de 2008, no qual foram realizados 26 testes para MPVh; segundo período, de maio de 2008 a fevereiro de 2009, no qual foram realizados 41 testes para MPVh. A comparação dos casos ocorridos nos dois períodos de tempo, utilizando teste exato de Fisher (com p-valor = 0,0032), altamente significante, mostrou que houve maior incidência do MPVh entre os meses de março e abril de 2008 (38,5%) (Tabela 3).

Na tabela 4 está estimada a razão de chance para condições de moradia, tabagismo, antecedente de cada uma das variáveis avaliadas para verificação da asma na família e na criança, pneumonia na criança, associação das variáveis clínicas e demográficas com condição nutricional, presença de febre, cansaço, o resultado positivo de MPVh, na qual se observa que tosse e diagnóstico não se mostraram estatisticamente sexo, dias de doença, local de moradia, renda familiar, associados ao MPVh (p > 0,05).

DISCUSSÃO

As IRA virais apresentam crescente importância quanto a morbidade e mortalidade em todo mundo, incluindo em crianças e adultos.

O MPVh e o VSR são considerados os agentes etiológicos virais mais incidentes de IRA na infância^5,15,31.

No Brasil, segundo dados do Ministério da Saúde, houve redução de 61,7% da mortalidade infantil e decréscimo no total de óbitos por IRA no período de 1990 a 2010. A Região Sul com menores índices e a Região Nordeste com a maior taxa de mortalidade infantil³². O perfil desta pesquisa é inédito na Região Amazônica, com informações sobre aspectos epidemiológicos e clínicos do MPVh.

No Brasil, as Regiões Sul e Sudeste apresentam correspondência de sazonalidade aos países de clima temperado, com surtos de MPVh durante outono, inverno e primavera, enquanto as Regiões Amazônica e Nordeste predominam em períodos mais chuvosos, podendo ocorrer casos em todos os meses do ano. Neste estudo, o maior número de casos positivos para MPVh ocorreu no mês de abril de 2008, correspondendo ao mês de maior índice pluviométrico do referido ano e ao período chuvoso da Região Amazônica (dezembro a maio).

Quanto à coleta de material desta pesquisa, foram utilizados aspirados nasofaríngeos. O método de detecção utilizado foi o RT-PCR em tempo real, considerado "padrão ouro" para o diagnóstico de metapneumovírus, pois gera resultados rápidos, com maior sensibilidade e especificidade, sendo uma importante técnica molecular alternativa para o isolamento viral^16,33.

VSR, influenza A e B, adenovírus e rinovírus são os mais relacionados em coinfecção com MPVh. A associação mais frequente é com o VSR, com citações de maior gravidade³⁴.

Neste estudo, houve detecção isolada de MPVh, com impossibilidade de análise quanto à coinfecção. Houve predomínio do sexo masculino nas crianças infectadas pelo MPVh (61,2%), correspondendo a vários outros estudos^17,35.

Há várias citações de sibilância correlacionadas ao MPVh³⁶. Neste estudo, os casos de sibilância não apresentaram significância estatística. Manifestações clínicas como corisa, febre, cefaleia, mal estar, tosse e sibilância relacionadas ao MPVh, são similares às ocorrências de outros pneumovírus, impossibilitando a determinação do agente etiológico viral, utilizando isoladamente o quadro clínico. Sintomas neurológicos, gastrointestinais, otites e outras manifestações clínicas extrarrespiratórias são relatadas em vários estudos associados a infecções por MPVh. Neste estudo, houve um caso com convulsão febril, dois casos com diarreia aguda, dois casos com artralgia e um caso com conjuntivite, todos com resultado negativo para MPVh.

Dos 67 pacientes com IRA neste estudo, 29,9% eram portadores de doença limitada ao sistema respiratório superior (DSRS) e 70,1% com doença do sistema respiratório inferior (DSRI) associados à DSRS. A otite média aguda (OMA) representa uma das complicações mais frequentes da infecção respiratória alta por MPVh. Nesta pesquisa ocorreram três casos de OMA com resultado negativo para MPVh. Em relação à DSRI ocorreram seis casos de pneumonia (8,9%) e quatro casos de bronquiolite (5,9%) com resultado negativo para MPVh.

Neste estudo, o percentual de identificação viral (MPVh) foi de 19,4%; ratificam-se relatos de estudos quanto à zonalidade na Região Amazônica e em relação aos aspectos clínicos que demonstram a idade (crianças mais velhas dentro da faixa etária de 1 mês e 5 anos) e a prostração, por meio de uma análise multivariada com (p < 0,1), como elementos do quadro clínico, com possibilidade de significância em relação à identificação de MPVh. A continuidade das pesquisas permitirá que outros aspectos sejam analisados como a gravidade dos casos associados ao pneumovírus referido, análise de coinfecções, epidemiologia molecular e diversidade genômica de MPVh circulantes^10,37,38.

Notou-se que a proporção de casos de MPVh, no período de março a abril de 2008, no qual foi observado um crescimento de 35,1%, corresponde aos picos de precipitação pluviométrica (período chuvoso), conhecido como inverno amazónico³⁹.

CONCLUSÃO

Após estudo clínico e avaliação de 67 casos de crianças com IRA, dos quais, 29,9% eram portadores de DSRS e 70,1% com DSRI associados à DSRS. Relatos de sazonalidade do MPVh neste estudo, compatíveis com pesquisas em regiões de semelhanças climáticas. O resultado de identificação viral (pelo RT-PCR em tempo real) neste estudo (19,4%), representa satisfatórias taxas de detecção de MPVh, como agente etiológico de IRA na infância, tanto em publicações internacionais e principalmente em estudos nacionais publicados. Em decorrência do número de casos da amostra e de parâmetros clínicos estudados, não foi possível estabelecer diferenças estatisticamente significativas, entre os casos com pesquisa positiva e os casos com pesquisa negativa para MPVh.

Houve maior incidência do MPVh no período chuvoso (38,5%), e redução significante de incidência (7,3%) no período não chuvoso p-valor 0,0047.

A intensificação de pesquisas em relação ao MPVh é necessária para melhor entendimento dos casos graves, da epidemiologia, caracterização genômica, amplificação de métodos de identificação viral. Faz-se necessária a divulgação por meio de estudos científicos, para conscientização dos profissionais de saúde com atuação em nível populacional, quanto às informações de vírus respiratórios habituais e vírus emergentes (bocavírus, coronavírus e MPVh), objetivando o estabelecimento de condutas terapêuticas e preventivas mais adequadas - uso racional de antimicrobianos, drogas antivirais eficientes e possibilidade futura de vacina eficaz.

AGRADECIMENTOS

A Universidade do Estado do Pará; a Wyller Alencar de Mello, Mirleide C. Santos e James L. Ferreira, do Instituto Evandro Chagas; à Norma Araujo, do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário João de Barros Barreto; à direção do Hospital de Pronto Socorro Municipal Humberto Maradei Pereira; e a todos os amigos e colegas que contribuíram para a concretização desta pesquisa.

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Orlando da Gama Rodrigues
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Recebido em / Received / Recibido en: 14/11/2014
Aceito em / Accepted / Aceito en: 3/8/2015

^*Artigo resultado de tese apresentada por Orlando da Gama Rodrigues ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Universidade Federal de São Paulo, sob orientação do prof. dr. Werther Brunow de Carvalho, para obtenção do título de Doutor em Medicina, em 2011, São Paulo, Brasil.