Genotipagem por spoligotyping de Mycobacterium tuberculosis obtidos de lâminas de Ziehl-Neelsen em Belém, Estado do Pará, Brasil

Spoligotyping of Mycobacterium tuberculosis in Ziehl-Neelsen-stained slides from Belém, Pará State, Brazil

Genotipado por spoligotyping de Mycobacterium tuberculosis obtenidos de láminas de Ziehl-Neelsen en Belém, Estado de Pará, Brasil

Ismari Perini Furlaneto^I; Emilyn Costa Conceição^II; Michele Lima de Brito^I; Ana Roberta Fusco da Costa^III; João Júlio Batista Monteiro^IV; Nelson Veiga Gonçalves^IV; Harrison Magdinier Gomes^V; Karla Valéria Batista Lima^III

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O spoligotyping é uma técnica molecular baseada na amplificação de uma região de repetições diretas polimórficas, a qual permite detectar e diferenciar Mycobacterium tuberculosis (MT). Neste estudo, foram genotipados MT obtidos de material fixado em lâminas coradas pela técnica de Ziehl-Neelsen (ZN), confeccionadas em laboratórios públicos de Belém. A identificação molecular de MT por spoligotyping em amostras de 102 indivíduos apresentou elevada sensibilidade, com 90 padrões de hibridização completos e concordantes entre si. A classificação dos genótipos foi realizada comparando os resultados obtidos com aqueles disponíveis no banco de dados internacional SITVITWEB. Foram observados 45 genótipos distintos, dos quais 35 previamente relatados e 11 ainda não relatados. Sessenta e um genótipos apresentaram-se compartilhados por duas a 15 amostras e 29 genótipos eram únicos. As famílias LAM, T, H e EAI foram as mais frequentes. Os bairros com maior concentração de casos foram Guamá, Jurunas e Terra Firme. A genotipagem por spoligotyping torna-se uma importante ferramenta no monitoramento de isolados em diferentes contextos epidemiológicos. A possibilidade de caracterizar genética e demograficamente estes microorganismos contribui para o melhor entendimento de como a doença é distribuída nesta população, no esclarecimento das transmissões e das contaminações cruzadas e na implementação de ações para o controle da tuberculose.

Palavras-chave: Mycobacterium tuberculosis; Tuberculose; Spoligotyping; Diagnósticos Moleculares; Técnicas de Tipagem Bacteriana; EAI.

ABSTRACT

Spoligotyping is a molecular method based on the amplification of a polymorphic direct repeat locus, which allows for the detection and identification of Mycobacterium tuberculosis. Samples of M. tuberculosis obtained from material fixed in Ziehl-Neelsen-stained slides from public laboratories in Belém, Pará State, Brazil, were genotyped in this study. The molecular characterization of M. tuberculosis through spoligotyping of samples from 102 patients showed high sensitivity, with 90 complete and matching hybridization patterns. The genotypes were classified based on a comparison of the results obtained with data available in the SITVITWEB international database. Of the 45 different genotypes observed, 35 had already been reported and 11 had never been reported. Sixty-one genotypes were observed in 2 to 15 samples, and 29 genotypes did not match. LAM, T, H and EAI were the most common families. The districts with the highest concentration of cases were Guamá, Jurunas and Terra Firme. Spoligotyping is considered an important tool to follow up isolates in distinct epidemiologic contexts. Genetic and demographic characterization of these microorganisms contributes to a better understanding of the distribution of tuberculosis in this population, its transmission process, the occurrence of cross contaminations, and the implementation of controlling measures of the disease.

Keywords: Mycobacterium tuberculosis; Tuberculosis; Spoligotyping; Pathology, Molecular; Bacterial Typing Techniques; EAI.

RESUMEN

El Spoligotyping es una técnica molecular basada en la amplificación de una región de repeticiones directas polimórficas, que permite detectar y diferenciar Mycobacterium tuberculosis. En este estudio, se genotiparon M. tuberculosis obtenidos de material fijado en láminas teñidas por la técnica de Ziehl-Neelsen (ZN), confeccionadas en laboratorios públicos de Belém. La identificación molecular de M. tuberculosis por spoligotyping en muestras de 102 individuos presentó una elevada sensibilidad, con 90 estándares de hibridación completos y concordantes entre sí. La clasificación de los genotipos se hizo comparando los resultados obtenidos con los disponibles en el banco de datos internacional SITVITWEB. Se observaron 45 genotipos distintos, de los cuales 35 previamente relatados y 11 todavía no relatados. Sesenta y un genotipos se presentaron compartidos en dos a 15 muestras y 29 genotipos eran únicos. Las familias LAM, T, H y EAI fueron las más frecuentes. Los barrios con mayor concentración de casos fueron Guamá, Jurunas y Terra Firme. El genotipado por spoligotyping se torna una importante herramienta en el monitoreo de aislados en diferentes contextos epidemiológicos. La posibilidad de caracterizar genética y demográficamente estos microorganismos contribuye a la mejor comprensión de como se distribuye la enfermedad en esta población, al esclarecimiento de las transmisiones y de las contaminaciones cruzadas y a la implementación de acciones para el control de la tuberculosis.

Palabras clave: Mycobacterium tuberculosis; Tuberculosis; Spoligotyping; Pathology, Molecular; Técnicas de Tipificación Bacteriana; EAI.

INTRODUÇÃO

No ano de 2010 foram notificados, no Brasil, 71 mil casos novos de tuberculose (TB), de todas as formas, ocorrendo 4,6 mil mortes devido à doença, correspondendo a uma incidência de 37,7/100 mil habitantes e a uma taxa de mortalidade estimada em 2,4/100 mil habitantes¹. O Pará é o Estado da Região Norte que concentra o maior número de casos novos da doença, tendo respondido por 50% das notificações em 2011, com 3,364 casos novos e uma taxa de incidência estimada em 47,3/100 mil habitantes, a terceira maior entre os estados brasileiros².

O Pará abriga 11 das 315 cidades que foram definidas pelo Ministério da Saúde (MS) como prioritárias para o controle da TB no Brasil porque, juntas, concentram 75% dos casos da doença no país. Belém, a sua capital, e outras dez cidades somam 60% dos casos no Pará³. A caracterização genética e demográfica de MT contribui para elucidar alguns aspectos quanto à dispersão deste micro-organismo, além de possibilitar a implementação de ações para seu controle e combate.

A genotipagem do MT tem sido um bom instrumento no estudo das relações de clonalidade e dispersão de cepas em grupos populacionais⁴. Nos últimos anos, foram desenvolvidos métodos de tipagem baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR)^4,7 que têm como vantagens a utilização de baixa quantidade de DNA como alvo para tipagem e serem de fácil execução. Destes, por sua simplicidade e demais vantagens, como menor custo e uso de espécimes clínicos diversos, o spoligotyping é atualmente o mais utilizado, também como método de tipagem secundário para cepas com menos de cinco cópias da IS6110^8,12.

Embora o RFLP-IS6110 seja considerado o método padrão-ouro para tipagem de membros do complexo M. tuberculosis (CMTB) diversas desvantagens têm sido relatadas quanto ao seu uso⁷. A técnica de spoligotyping tem sido empregada com sucesso em diversos tipos de amostras, tais como tecidos preservados em parafina, tecidos mumificados, amostras de escarro e lâminas coradas pela técnica de ZN, tanto recentes quanto antigas^13,15.

Neste estudo, foram genotipados, por spoligotyping, MT obtidos a partir de lâminas coradas pela técnica de ZN, confeccionadas em unidades laboratoriais (UL) da rede pública de Belém entre outubro de 2007 e março de 2008, avaliando-se a aplicabilidade da técnica neste tipo de amostra e a distribuição dos genótipos na região.

MATERIAIS E MÉTODOS

O estudo foi dividido em duas fases: na primeira, foram selecionadas, aleatoriamente, 102 lâminas com baciloscopia positiva e com diferentes contagens de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR); na segunda, foram selecionados 32 pacientes, dentre os 102, que realizaram o exame mais de uma vez e tiveram, individualmente, uma lâmina extra incluída no estudo, a qual foi utilizada para comparar os perfis de hibridização obtidos em diferentes amostras de um mesmo indivíduo. Desta forma, as amostras clínicas consistiram em 134 lâminas com esfregaços de escarro previamente coradas pela técnica de ZN, provenientes de algumas UL, encaminhadas ao Laboratório Central do Pará (LACEN-PA) e cedidas para o desenvolvimento deste trabalho.

O DNA foi extraído conforme proposto por Furlaneto et al¹². O spoligotyping foi realizado de acordo com as instruções do fabricante (Isogen Bioscience B.V, Maarsen, HOLANDA), com algumas modificações¹⁶. Para verificar a reprodutibilidade da técnica, o spoligotyping foi realizado em duplicata a partir de nova amplificação do DNA das mesmas amostras para ambas as fases em dias distintos e utilizando-se membranas diferentes. O MT H37Rv e M. bovis foram utilizados como controle positivo. Como controle negativo utilizou-se água previamente submetida aos procedimentos de extração. Este controle negativo também foi usado para avaliar a possibilidade de contaminação cruzada laboratorial.

Os resultados foram analisados visualmente por dois avaliadores experientes, para estabelecer um consenso de leitura dos padrões. Os genótipos obtidos foram inscritos em formato binário como planilhas de Excel^® (Microsoft, Redmond, WA, EUA) e comparados com os padrões descritos no banco de dados SITVIT (disponível em: http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVITDemo/), a fim de identificar o Spoligo Internacional Type (SIT) correspondente. Padrões ainda não descritos foram classificados em prováveis famílias de acordo com Vitol et al¹⁷ (disponível em: http://cgi2.cs.rpi.edu/~bennek/SPOTCLUST.html). Os genótipos que não parearam com nenhum outro previamente descrito nos bancos de dados foram definidos neste estudo como órfãos. Foi definido como cluster um grupo de duas ou mais amostras que tiveram padrões idênticos de spoligotyping provenientes de indivíduos distintos.

GEOLOCALIZAÇÃO DOS CASOS

A localização dos casos incluídos no estudo foi analisada através do registro de coordenadas geográficas (latitude e longitude) no local de residência de cada paciente, com o auxílio de aparelho receptor do Sistema de Posicionamento Global (GPS) (GPS Map60CSx, GARMIN, Olathe, Kansas, EUA), e, para a base de dados formada com estas informações, foi utilizado software compatível para integrar as bases cartográficas, imagens digitais e o conteúdo do estudo (ArcGIS 9.2, ESRI, EUA; TerraView 3.1, INPE, Brasil). A base cartográfica do Município de Belém foi cedida pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) para o Laboratório de Geoprocessamento do Instituto Evandro Chagas.

O endereço dos indivíduos foi obtido por meio de consulta ao Livro de Baciloscopia e Cultura enviado pela unidade laboratorial (UL) ao LACEN-Pa.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o BioEstat, versão 5.0¹⁸. Foram utilizados os testes χ2 e Kappa e o valor de p ≤ 0.05 foi usado para definir a significância das variáveis.

APROVAÇÃO ÉTICA

O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Humanos do Instituto Evandro Chagas (CEP/IEC/SVS/MS) em 06 de abril de 2009, parecer n° 003/2009, protocolo CEP/IEC n^o 0004/2009, CAAE: 0004.0.072.073-09.

RESULTADOS

Em 93/102 DNA (91,2%) obtidos de esfregaço de escarro de pacientes com bacterioscopia positiva para BAAR, o spoligotyping foi bem sucedido, apresentando padrões genéticos reprodutíveis nos DNA de lâminas em duplicata dos mesmos pacientes. Apenas 8,8% das amostras tiveram padrões duvidosos, não sendo possível elucidá-los mesmo após repetição da genotipagem. Todas as amostras que apresentaram padrões duvidosos permaneceram sem definição mesmo após a repetição do experimento. Os controles positivos MT H37Rv e M. bovis apresentaram os padrões de hibridização característicos e não houve sinal de hibridização entre os controles negativos. Não foi significativa a diferença quanto à carga bacilar entre as amostras que apresentaram padrões de hibridização completos e as de padrão duvidoso (p = 0,2335).

Em três casos foram observadas discordâncias entre os perfis de hibridização apresentados por amostras diferentes de um mesmo indivíduo, embora todas apresentassem resultados concordantes entre si após as duplicatas.

Das 90 amostras com padrão genético completo e sem discordância, 79 (87,8%) foram classificadas em 35 SIT. Destas, 20 apresentaram padrões únicos e 15, padrões compartilhados (Tabela 1). Onze amostras exibiram padrões genéticos ainda não descritos, compreendendo nove padrões únicos e um padrão compartilhado por duas amostras (Tabela 2). Entre estes genótipos, três pareavam com perfis descritos como órfãos no SITVITWEB, sendo estes provenientes do Brasil, Itália e Portugal.

A família Latin American and Mediterranean (LAM) foi a mais frequente, agrupando 35 (38,8%) amostras, seguidas pelas famílias T, East African-Indian (EAI) e Haarlem (H), que apresentaram 25, 8 e 7 amostras, respectivamente. Oito SIT acomodaram 49,4% das amostras (SIT53, SIT42, SIT100, SIT93, SIT137, SIT17, SIT50 e SIT740). A subfamilia T1 reuniu 23,3% das amostras, sendo a mais frequente neste estudo (Tabelas 1 e 2).

Dos 102 casos de Belém, foram registradas as coordenadas geográficas de 81 (79,4%) deles, não sendo possível localizar o endereço dos demais (21; 20,6%), apesar de constarem no Livro de maneira aparentemente completa. A distribuição total dos casos georreferenciados em Belém de acordo com o spoligotyping está representada na figura 1. Os 81 casos estavam distribuídos por 29 dos 71 bairros da capital. Os bairros que mais concentraram casos foram Guamá (9; 11,1%), Jurunas (6; 7,4%) e Terra Firme (5; 6,2%).

DISCUSSÃO

No presente estudo, que utilizou DNA extraído de esfregaços fixados em lâminas de ZN, padrões genéticos completos e reprodutíveis foram obtidos em 90% das amostras. Estudos prévios relataram rendimento menor quando a técnica foi aplicada na tipagem de material extraído de lâminas de ZN^14,15.

As famílias mais frequentes neste estudo (LAM, T e Haarlem) também reuniram maior número de casos em outros estudos realizados no Brasil^20,22, assim como em outros países da América Latina^19,23,24. A prevalência da família LAM, que agrupou 39,3% das amostras genotipadas, também tem sido observada no Paraguai²⁵ e na Venezuela²⁶.

Amplamente distribuídos, os tipos SIT53 (T1) e SIT42 (LAM9) agruparam maior número de amostras, englobando, juntos, 27,7% de todos os casos deste trabalho. Investigações mais detalhadas devem ser realizadas para se verificar a transmissão e/ou melhor adaptação destes genótipos. Eles ocuparam, respectivamente, a 2^a e a 5^a posição entre os mais frequentes no SpolDB4²⁷. Entre os SIT encontrados, alguns ainda não foram descritos em Belém (SIT 4, 60, 216, 435 e 1907) e um ainda não foi referenciado no Brasil (SIT209), ocorrendo, porém, em países vizinhos ou com relações com o país, como Venezuela, EUA, Itália, Espanha²⁴. O SIT1999 apresenta cinco amostras depositadas no SITVITWEB, sendo três da Guiana Francesa e duas da Itália.

Quanto à família EAI, sua presença na América do Sul é pouco relatada. De fato, nenhum isolado desta família foi relatado em diversos estudos realizados recentemente no Paraguai²⁵, na Venezuela^26,28 e no Chile²⁹. No entanto, há relatos na Guiana Francesa²⁴ e no Brasil²¹, onde observaram-se particularidades em relação à distribuição desta família no país. Gomes et al²¹, em estudos realizados em 11 Estados brasileiros, descrevem a presença de cepas de EAI somente no Pará, Pernambuco e Rio de Janeiro, sendo que 76,2% dos isolados eram provenientes do Pará, onde estavam presentes os SIT 48 e 129, os quais foram também descritos no presente trabalho. Estes achados parecem confirmar a hipótese levantada por Gomes et al²¹, de que estas cepas foram exportadas da Guiana Francesa para o Brasil, já que esta família tem baixa representatividade no Brasil e é intensa na Guiana. Não foram observados genótipos pertencentes às famílias Beijing e CAS e nem de tipos pertencentes às outras espécies do CMTB, como o M. bovis, por exemplo. De fato, a presença do genótipo Beijing é raramente observada em pacientes com TB na América do Sul^23,30,31.

As três amostras que apresentaram perfis de spoligotyping discordantes foram excluídas das comparações com os bancos de dados. No entanto, o fato de seus resultados terem se confirmado após as duplicatas, aliado à ausência de hibridização entre os controles negativos, pode sugerir a presença de genótipos diferentes em um mesmo paciente. Embora tradicionalmente seja assumido que a TB ativa é resultado de infecção com único clone bacteriano e que recorrências são resultado da reativação da cepa que causou o primeiro episódio, infecções simultâneas por múltiplas cepas ou reinfecção por uma segunda estirpe de MT podem ser responsáveis por uma parcela dos casos da doença^32-36. No entanto, considera-se importante utilizar reagentes que evitem o carreamento de DNA e posterior contaminação, como uracil DNA glicosilase e dUTP³⁷. Para confirmação da presença de infecção policlonal, seria necessário o cultivo micobacteriano e análise de colônias individuais por spoligotyping e uma técnica secundária, como o MIRU-VNTR ou por RFLP-IS6110.

Os mapas temáticos são instrumentos valiosos na análise espacial do risco de determinada doença, permitindo sugerir a distribuição espacial da doença na região de interesse, os determinantes locais, fatores etiológicos e apontar associações entre as fontes de contaminação e as áreas de risco elevado³⁸.

A proposta do presente estudo, em relação à distribuição espacial dos casos, foi descritiva. Por meio da localização pontual da residência dos casos e ilustração dos mesmos em mapas, foi possível observar áreas onde houve certo agrupamento de casos com o mesmo perfil de Spoligotyping, como aconteceu com os casos pertencentes aos agrupamentos SIT64 (mesma residência), SIT100 (100 m) e SIT53 (290 m), em Belém. Este fato chama atenção para a possibilidade de que os casos que possuem o mesmo genótipo participem da mesma cadeia de transmissão, ressaltando a importância de aumentar a vigilância e investigação nesta área. Por outro lado, como o período selecionado para obtenção das amostras foi de seis meses e não envolveu a totalidade dos casos com baciloscopia positiva, algumas áreas não tiveram nenhum ponto localizado (como foi o caso da parte leste de Belém), o que não significa ausência de casos nestas localidades.

Alguns bairros apresentaram maior concentração de pontos (casos), independentemente do genótipo (SIT): os bairros Guamá, Jurunas e Terra Firme, que, em conjunto, concentraram 24,7% dos casos geolocalizados. Avaliando as características da população neles residente, observa-se que estão entre os bairros mais populosos da capital paraense e contam com as médias mais elevadas de moradores por domicílio^39,40.

Outro fator que influenciou na redução dos casos disponíveis para este estudo foi a exclusão inicial de 27,2% das amostras por motivos relacionados ao endereço (ausente/ incompleto/ outro município). Em estudo exploratório realizado por Dos Santos et al⁴¹, frente à dificuldade de localizar alguns endereços, os autores presumiram que os endereços incompletos e consequentemente difíceis de serem localizados pertenciam a áreas carentes, podendo resultar em uma subestimação de casos nos bolsões urbanos de pobreza.

Estudos que avaliam a totalidade de isolados disponíveis de uma determinada área geográfica em um tempo definido podem ajudar a estimar a importância da transmissão recente e a identificar os fatores de risco para a disseminação da TB⁴³. E importante salientar que investigações de traçado convencional de contatos identificam somente uma pequena parcela dos casos envolvidos em uma cadeia de transmissão, o que exige novas abordagens⁴⁴.

CONCLUSÃO

A técnica spoligotyping é simples, prática e reprodutiva para genotipagem de MT provenientes de lâminas coradas pelo método de Ziehl-Neelsen, permitindo inclusive a detecção de infecções mistas, podendo ser inserida na rotina dos Laboratórios de Vigilância.

As famílias LAM, T e H foram as mais frequentes neste estudo, da mesma forma como em outros estudos realizados no Brasil e América Latina. A família EAI está entre as mais frequentes na população estudada; no entanto, é raramente relatada na América Latina.

O preenchimento inadequado das informações referentes ao endereço dos indivíduos aponta para a necessidade de qualificar o sistema de coleta, organização e armazenamento de dados, para que estes possam ser acessados quando necessário e, validados, se tornem parte integrante da vigilância da TB e de outras doenças que possam ser objeto de investigação futura. Somente desta forma estes dados permitirão a utilização de abordagens de estatística espacial que ajudem a definir, de forma clara e segura, os fatores de risco aos quais a comunidade está exposta.

AGRADECIMENTOS

A farmacêutica Zelinda Habib Dantas de Santana, responsável pelo Serviço de Tuberculose/LACEN-PA e ao farmacêutico Kleiffson Alves de Miranda, diretor do LACEN-PA por autorizar o fornecimento das lâminas.

APOIO FINANCEIRO

Este trabalho foi realizado com apoio financeiro do Instituto Evandro Chagas/SVS/MS, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior e Programa de Iniciação Científica/IEC/CNPq.

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Correspondência / Correspondence / Correspondencia:
Karla Valéria Batista Lima
Instituto Evandro Chagas,
Seção de Bacteriologia e Micologia ]]> Rodovia BR 316, km7, s/n^o.
Bairro: Levilândia
CEP: 67030-000
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E-mail: karlavaleria_2007@hotmail.com

Recebido em / Received / Recibido en: 28/6/2012
Aceito em / Accepted / Aceito en: 16/1/2013